大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞干細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及藥物的干預(yù)研究.pdf

1、目的：如何動(dòng)員內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖在缺血性腦損傷治療中己成為又一個(gè)研究重點(diǎn)，而神經(jīng)細(xì)胞干細(xì)胞因子(SCF)在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖中作為主要的存活刺激因子而存在，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖可能起促進(jìn)作用。本文重點(diǎn)觀察神經(jīng)細(xì)胞SCFmRNA在大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間的表達(dá)情況，以及自配康腦液(主要由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七等組成)干預(yù)后，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SCFmRNA表達(dá)的影響，這種通過(guò)藥物改善腦血液循環(huán)后，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SCFmRNA表

2、達(dá)規(guī)律的研究還未見報(bào)道，康腦靈單方劑已明確具有擴(kuò)張血管、增加血流量，有腦保護(hù)作用。應(yīng)用藥物干預(yù)旨在探討在缺血再灌注損傷后通過(guò)SCFmRNA表達(dá)規(guī)律的研究，間接反映在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖領(lǐng)域的活血化淤藥物的應(yīng)用價(jià)值。 材料與方法：本組實(shí)驗(yàn)選用雄性SD大鼠36只，以線拴法建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型(MCAO)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組：缺血1.5h再灌注1 d、3d、7d、14d組、藥物干預(yù)組：(建立同樣MCAO模型)，胃飼康腦液2ml(配

3、制)/每日晨一次直至處死、其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。每組4只，假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)組及藥物干預(yù)組動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間內(nèi)取材：分別于缺血1.5h再灌注1d、3d、7d、14d取材；假手術(shù)組于手術(shù)后1 d取材。大鼠在10％水和氯醛(300mg/kg)麻醉下，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，依次灌入生理鹽水200ml、4％的多聚甲醛300ml，灌注完畢后開顱，于前囟前2mm至前囟后3mm之間取腦，切塊厚度5mm，置入4％的多聚甲

4、醛(含1/5000DEPC)中固定40分鐘，蒸餾水浸泡4h.常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，厚度6 μm，粘于多聚賴氨酸處理后的玻片上。37℃烤箱過(guò)夜后室溫保存。采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)腦缺血再灌注后不同時(shí)間的SCFmRNA的表達(dá)。原位雜交步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行：1.石蠟切片厚度6 μm。2.采用多聚賴氨酸處理玻片。3.石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。4.暴露mRNA核酸片段。5.后固定：胃蛋白酶消化后，室溫固定10分鐘。6.

5、預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備：干的雜交盒底部加20％甘油20ml以保持濕度。7.雜交：每張切片20 μι雜交液，加在切片上。將原位雜交用蓋玻片，蓋在切片上。8.雜交后洗滌。 9.滴加封閉液，甩去多余液體，不洗。10.滴加生物素化鼠抗地高辛。11.滴加SABC。 12.滴加生物素化過(guò)氧化物酶。13.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。14.蘇木素復(fù)染，充分水洗。15.酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。16.原位雜交信號(hào)顯示：DAB顯色，光鏡下觀察，

6、出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，位于胞漿。 結(jié)果：對(duì)腦缺血再灌注后不同時(shí)間的皮質(zhì)區(qū)、紋狀體區(qū)的SCFmRNA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析：每400倍光鏡視野下：1、假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)：10.15±3.50個(gè)；紋狀體區(qū)：14.50±1.61個(gè)。 2、實(shí)驗(yàn)組：皮質(zhì)區(qū)：第1d：33.20±0.42個(gè)，第7d：67.50±3.07個(gè)，第14d：31.63±1.31個(gè)；紋狀體區(qū)：第1d：41.34±0.21個(gè)，第7d：64.44±4.68個(gè)，第14天：36.1

7、1±0.50個(gè)。實(shí)驗(yàn)組表達(dá)規(guī)律：第1d陽(yáng)性細(xì)胞開始增加，第7d達(dá)高峰，第14d下降，神經(jīng)細(xì)胞SCF mRNA的表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，兩者有顯著性差異(P<0.01)2、藥物干預(yù)組：皮質(zhì)區(qū)：第1d 30.38±0.46個(gè)，第7d：63.24±3.68個(gè)。第14d： 30.11±0.42個(gè)；紋狀體區(qū)：第1d 39.38±0.76個(gè)，第7d：64.46±4.38個(gè)，第14d： 33.71±0.61個(gè)。神經(jīng)細(xì)胞SCFmRNA表達(dá)與實(shí)驗(yàn)組有相同

8、的表達(dá)規(guī)律，與實(shí)驗(yàn)組相比陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 結(jié)論：腦缺血再灌注損傷后，神經(jīng)細(xì)胞SCFmRNA表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)規(guī)律與所報(bào)道的神經(jīng)干細(xì)胞的巢蛋白表達(dá)規(guī)律相似，提示SCF可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。藥物干預(yù)后，SCFmRNA表達(dá)規(guī)律與實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異，提示康腦液在改善腦血液循環(huán)的同時(shí)，對(duì)SCFmRNA的表達(dá)規(guī)律無(wú)明顯影響。這項(xiàng)結(jié)果可能表明，一方面，康腦液能夠改善腦血液循環(huán)，擴(kuò)張血管，增加血流量，起到腦保