豬Siglec-1基因啟動子克隆及其在肺泡巨噬細胞特異性表達的驗證.pdf

1、豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophage，PAM）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染的靶細胞。為使抗PRRSV的外源基因在靶細胞中高效、特異性表達，培育出豬的抗PRRS轉(zhuǎn)基因新品系，篩選豬PAM特異性表達基因啟動子是非常重要的。真核生物基因在無轉(zhuǎn)錄因子參與時，RNA聚合酶自身不能啟動轉(zhuǎn)錄，故處于不

2、表達狀態(tài)，只有當轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在其識別的DNA序列上后，基因才開始表達。因此，對特異表達基因啟動子的研究既包括啟動子區(qū)順式作用元件確定又包含轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用。
　　 研究表明豬唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素1（sialoadhesin，Sn;又稱為Siglec-1）是介導(dǎo)PRRSV黏附和內(nèi)化巨噬細胞的關(guān)鍵受體，在豬肺泡巨噬細胞上高表達。本研究采用啟動子缺失表達載體，研究了Siglec-1基因啟動子在豬肺泡巨噬細胞、脂肪前體細胞、成

3、纖維細胞和腎細胞的表達活性，獲得具有特異性調(diào)控功能的啟動子區(qū)，并初步研究了其在肺泡巨噬細胞高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。方法如下:
　　 1 RACE技術(shù)確定Siglec-1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點
　　 通過NCBI下載豬Siglec-1基因mRNA序列，并設(shè)計5'-RACE特異性引物。依據(jù)Smarter RACE kit克隆出Siglec-1基因5'喘轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，確定其轉(zhuǎn)錄起始位點為C，位于起始密碼子ATG上游88bp處。Sig

4、lec-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點的確定為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 2Siglec-1基因啟動子缺失表達載體構(gòu)建
　　 首先，利用生物信息學(xué)方法查找豬Siglec-1基因5'端調(diào)控序列，預(yù)測出啟動子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點大概位置;其次，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增不同長度缺失片段的啟動子，分別連接到螢火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic上，經(jīng)酶切、測序鑒定成功構(gòu)建了九種重組表達載體pLUC173、pLUC574、pLUC

5、691、pLUC740、pLUC869、pLUC901、pLUC1444、pLUC2188、 pLUC3412。
　　 3缺失啟動子活性分析及細胞特異性驗證
　　 將啟動子缺失表達載體與海腎熒光素酶報告載體pRL-TK按照20∶1共轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細胞，24小時后，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，以pRL-TK熒光活性值為內(nèi)參照，并將pGL3-Basic的基礎(chǔ)活性值定為1，分析缺失啟動子活性，篩選出核心啟動子區(qū)為pL

6、UC173、活性最高啟動子為pLUC869。同樣條件下將這兩種載體瞬時轉(zhuǎn)染其他非巨噬細胞（豬腎細胞、脂肪前體細胞、豬胎兒成纖維細胞）確定細胞特異性的啟動子片段。
　　 4啟動子突變分析
　　 通過生物信息學(xué)分析和實驗研究相結(jié)合，初步探明轉(zhuǎn)錄因子PU.1對于Siglec-1基因肺泡巨噬細胞高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，定點突變PU.1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點后導(dǎo)致Siglc-1基因表達下調(diào)，提示轉(zhuǎn)錄因子PU.1可能對于Siglec-1基因