HMGA2在卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用及機制研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌而位列第三位1。在中國，由于其高度惡性，致死率位列婦科腫瘤的首位。到目前為止，卵巢癌的病因尚不清楚。人們認(rèn)為，它的發(fā)病可能與環(huán)境、內(nèi)分泌、遺傳等各個因素密切相關(guān)2。根據(jù)臨床病理類型和遺傳特征的不同，卵巢癌可分為Ⅰ型和Ⅱ型。其中Ⅰ型卵巢癌惡性程度較低，進(jìn)展較慢，包括低度惡性漿液性卵巢癌、粘液性卵巢癌、透明細(xì)胞樣卵巢癌、子宮內(nèi)膜樣卵巢癌等，在這類卵巢癌中，主要發(fā)生了KR

2、AS、BRAF、PTEN等基因的突變3。而Ⅱ型卵巢癌惡性程度高，進(jìn)展迅速，在這類腫瘤中，TP53和/或BRCA1/BRCA2的基因突變比較常見，主要的病理類型為高度惡性漿液性卵巢癌3-6。在卵巢癌發(fā)生的早期，患者一般無明顯臨床癥狀或僅有較輕癥狀可見7。70％的患者就診時已至晚期（Ⅲ期和Ⅳ期），此時卵巢癌生長迅速，并且極易發(fā)生侵襲、擴(kuò)散和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。卵巢癌的5年生存率僅為30％，迄今為止，無有效治療手段8,9。由于卵巢癌極高的惡性程度和極低

3、的生存率，它的生物學(xué)行為、發(fā)病和進(jìn)展機制一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點10。
　　 HMGA2(highmobilitygroupAT-hook2)，即高遷移率族蛋白A2，它在胚胎發(fā)育的早期、多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用11。人類HMGA2基因定位于12q13-15，它編碼的蛋白作為構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子，參與了許多生物學(xué)過程。例如，在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，HMGA2通過降低p16lnk4a和p19Arf的表達(dá)，促進(jìn)小鼠

4、神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新12;在小鼠垂體腺瘤中，HMGA2通過直接上調(diào)CCNB2，促進(jìn)細(xì)胞增殖13;同時，HMGA2還參與DNA損傷修復(fù)過程，一方面，通過直接抑制ERCC1的表達(dá)，影響核苷酸切除修復(fù)(NER,nucleotideexcisionrepair)14;另一方面，通過抑制DNA依賴性蛋白激酶的活性，抑制非同源末端連接修復(fù)(NHEJ，nonhomologousendjoiningrepair)15。HMGA2作為機體發(fā)育和細(xì)胞分化所

5、必須的一個蛋白，在胚胎發(fā)育的早期高度表達(dá)，隨著發(fā)育的進(jìn)行，到胚胎發(fā)育的晚期和在分化完全的成熟細(xì)胞和組織中，它的表達(dá)會被完全關(guān)閉16。人們發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織，例如胰腺癌17-21、非小細(xì)胞性肺癌22，23、結(jié)直腸癌24、乳腺癌25-28、卵巢癌29-34等惡性腫瘤中，HMGA2作為一個原癌蛋白，均高度表達(dá)，提示HMGA2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用13，35-40。
　　 microRNAs是一類在種系之間高度保守、分

6、子量約為20-25nt的小RNA分子，在基因的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的功能。成熟microRNAs最初是由基因組編碼的，隨后經(jīng)核酸酶的剪切、加工和出核過程，在細(xì)胞質(zhì)中形成沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對原則識別靶mRNA的3'UTR區(qū)域，通過沉默復(fù)合體的作用降解mRNA分子或抑制mRNA的翻譯過程，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。Let-7家族是目前研究最熱的miRNA家族之一，共有11個成員，包括let-7a、b、c、d、e、f、g

7、、h、i、j、k。人們發(fā)現(xiàn)，在HMGA2的3'UTR區(qū)域中，存在有8個let-7的互補位點，其中6個位點的序列在種系之間高度保守，并且發(fā)現(xiàn)HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄后水平被let-7負(fù)調(diào)控。在胚胎發(fā)育早期和腫瘤組織中，let-7低表達(dá)、HMGA2高表達(dá);而在胚胎發(fā)育晚期和分化成熟的正常組織中，則呈現(xiàn)出了相反的趨勢，let-7高表達(dá)、HMGA2低表達(dá)。Let-7對HMGA2的精確負(fù)調(diào)節(jié)，在機體的正常胚胎發(fā)育和腫瘤的形成發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的

8、作用。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，簡稱EMT(epithelial-mesenchymaltransition)，包括生理性和病理性EMT，是指在各種生理性或者病理性因素的影響下，上皮細(xì)胞逐漸丟失了細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密粘附連接，E-cadherin的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞形態(tài)逐漸從上皮樣細(xì)胞狀態(tài)向間質(zhì)樣細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變，繼而使細(xì)胞運動性增加的一個過程41-44。其后果是，一方面，上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架被重新組織，上皮細(xì)胞逐漸被賦予間質(zhì)細(xì)胞表型4

9、5，46;另一方面，細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用發(fā)生改變，上皮細(xì)胞逐漸丟失了它們之間的緊密粘附連接，細(xì)胞的運動和遷移能力增加，而使上皮細(xì)胞逐漸發(fā)生間質(zhì)化的一個過程47-50。EMT在胚胎發(fā)育早期、腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移、慢性炎癥后的纖維化過程中均發(fā)揮著非常重要的作用51-54。人們發(fā)現(xiàn)，HMGA2與EMT過程密切相關(guān)55。在小鼠乳腺癌中，Sylvie等發(fā)現(xiàn)，HMGA2參與了TGF-β/Smads通路，HMGA2能夠與Sm

10、ads蛋白相互結(jié)合，且兩者均能結(jié)合至Snail1基因的啟動子區(qū)域，三者的相互結(jié)合促進(jìn)Snail1基因的轉(zhuǎn)錄，隨后Snail1通過對E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平的抑制，最終導(dǎo)致EMT過程的發(fā)生55，56。另外，Sugiko等發(fā)現(xiàn)，在人類胰腺癌中，HMGA2是MEK的間接靶基因，HMGA2能夠與Snail1基因啟動子區(qū)域直接結(jié)合，一方面抑制了E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，另一方面激活了Vimentin和N-cadherin的表達(dá)，兩者的共同

11、作用促進(jìn)了EMT過程的發(fā)生20。除此之外，HMGA2還參與了Wnt/β-catenin信號通路所介導(dǎo)的EMT過程40。綜上所述，HMGA2參與多條EMT相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)57-60，是EMT發(fā)生過程中的一個關(guān)鍵分子。
　　 在我們課題組的先期研究中，我們通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在漿液性輸卵管上皮內(nèi)癌(STIC，seroustubalintraepithelialcarcinoma)，即高度惡性漿液性卵巢癌(HG-PSC，hig

12、h-gradepapillaryserouscarcinoma)的癌前病變階段，有75％的組織高度表達(dá)HMGA2。并且在HG-PSC階段，在70％的組織中，HMGA2高度表達(dá)。這些證據(jù)表明HMGA2在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用31。因此，為了深入理解HMGA2在卵巢癌中的作用，我們選取了T29和T80這兩個永生化的卵巢上皮細(xì)胞系作為我們的細(xì)胞材料，構(gòu)建了HMGA2穩(wěn)定過表達(dá)的卵巢上皮細(xì)胞模型，并利用該模型對HMGA2在

13、卵巢癌EMT發(fā)生過程中的作用和機制做了進(jìn)一步的研究30。
　　 第一，HMGA2的過度表達(dá)能夠誘導(dǎo)卵巢上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，增強卵巢上皮細(xì)胞的耐藥性，并顯著提高裸鼠的皮下成瘤能力:我們首先利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建了HMGA2穩(wěn)定過表達(dá)的卵巢上皮細(xì)胞模型，隨后利用軟瓊脂克隆形成實驗、Matrigel侵襲實驗、紫杉醇/順鉑的耐藥實驗和裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)HMGA2的過度表達(dá)能夠使卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化

14、能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、耐藥性和裸鼠的皮下成瘤能力均顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞模型在裸鼠皮下形成的腫瘤組織與臨床卵巢癌組織的病理特征比較相似，并且具有明顯的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征，提示HMGA2在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和EMT過程中起著非常重要的作用。
　　 第二，干擾HMGA2的表達(dá)可以減弱卵巢癌細(xì)胞的惡性程度，降低細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，減緩細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞的形態(tài)從間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)變:我們使用siRNA、let-7c、sh-HMGA2等方式

15、分別干擾T29A2-/T80A2-、T29A2+、SKOV3細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)，隨后利用軟瓊脂克隆形成實驗、Matrigel侵襲實驗、MTS增殖實驗和觀察細(xì)胞形態(tài)的方法發(fā)現(xiàn)干擾HMGA2的表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力顯著降低，并且能夠使細(xì)胞的形態(tài)從間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)變。我們從反方面證實了HMGA2在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 第三，HMGA2通過在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控Lumican的表達(dá)而促進(jìn)卵巢

16、癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化:我們首先利用miRNA芯片和基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)了一系列HMGA2的靶基因，包括一組EMT相關(guān)基因，其中Lumican是降幅最大的一個基因。隨后，我們使用RT-PCR、WesternBlot、siRNA、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)等實驗，證實了HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控Lumican的表達(dá)。并且利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建了Lumican過度表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系，通過Matrigel侵襲實驗發(fā)現(xiàn)Lumican的過度表達(dá)

17、能夠抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 第四，HMGA2通過在轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控STC2的表達(dá)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT過程的發(fā)生;STC2可作為高度惡性漿液性卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)，STC2的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān):STC2是芯片中升幅比較大的一個基因。我們使用RT-PCR、WesternBlot、siRNA、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)等實驗，證實了HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控STC2的表達(dá)。并且，我們構(gòu)建了穩(wěn)定干擾STC2表達(dá)的細(xì)胞系，利用

18、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗證明穩(wěn)定干擾STC2的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的遷移過程，利用體內(nèi)實驗證明穩(wěn)定干擾STC2的表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力顯著降低。我們利用免疫組織化學(xué)染色的方法，發(fā)現(xiàn)在高度惡性漿液性卵巢癌中，HMGA2和STC2均高度表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。最后，我們對95例高度惡性漿液性卵巢癌患者進(jìn)行生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)STC2的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即STC2的表達(dá)越高的患者，預(yù)后越差，生存時間越短。

19、r>　　 綜上所述，HMGA2作為一個轉(zhuǎn)錄因子，通過在轉(zhuǎn)錄水平對Lumican的負(fù)調(diào)控和在轉(zhuǎn)錄水平對STC2的正調(diào)控，在卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移和EMT發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。實驗結(jié)果為將來臨床遏制和干預(yù)惡性腫瘤的晚期遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供了新的實驗與理論依據(jù)。
　　 第一部分，HMGA2的過度表達(dá)對卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移能力和耐藥性等方面的影響
　　 為了觀察HMGA2的過度表達(dá)所引起的卵巢上皮細(xì)胞的行為學(xué)改變，在本課題中

20、，我們選用了兩個卵巢上皮細(xì)胞(T29和T80)作為我們的細(xì)胞模型。我們除了構(gòu)建高度表達(dá)無3'UTR區(qū)域的HMGA2蛋白的T29細(xì)胞(在T29細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了pBabe-HMGA2-withoutUTR載體，該細(xì)胞命名為T29A2-)之外，還構(gòu)建了高度表達(dá)有3'UTR區(qū)域的HMGA2蛋白的細(xì)胞(在T29細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了pBabe-HMGA2-withUTR載體，該細(xì)胞命名為T29A2+)。我們構(gòu)建并使用T29A2+細(xì)胞以研究let-7對HMGA2

21、的調(diào)控以及l(fā)et-7在卵巢癌中的作用。卵巢上皮細(xì)胞模型構(gòu)建完成之后，隨后我們分別利用軟瓊脂克隆形成實驗、Matrigel侵襲實驗、紫杉醇/順鉑的耐藥實驗和裸鼠皮下成瘤實驗對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、耐藥性和體內(nèi)成瘤能力進(jìn)行了檢測。
　　 1.構(gòu)建多種HMGA2穩(wěn)定過表達(dá)的單克隆細(xì)胞系及對照細(xì)胞系:
　　 (1)轉(zhuǎn)入了pBabe空白載體的陰性對照細(xì)胞系:T29-pB，T80-pB;
　　 (2)轉(zhuǎn)入了pBa

22、be-HMGA2-withUTR載體（編碼的是有3'UTR區(qū)域的HMGA2蛋白）的細(xì)胞系:T29A2+;
　　 (3)轉(zhuǎn)入了pBabe-HMGA2-withoutUTR載體（編碼的是無3'UTR區(qū)域的HMGA2蛋白）的細(xì)胞系:T29A2-，T80A2-。
　　 隨后，我們分別利用RT-PCR和WesternBlot的方法對各細(xì)胞系的HMGA2的表達(dá)進(jìn)行了檢測。我們發(fā)現(xiàn)，雖然T29A2+和T29A2-細(xì)胞內(nèi)的HMGA2均高

23、表達(dá)，但是T29A2+細(xì)胞中的HMGA2表達(dá)水平不及T29A2-細(xì)胞。這表明T29A2+細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性的let-7，let-7能與HMGA2蛋白的3'UTR區(qū)域結(jié)合，從而下調(diào)其表達(dá);而T29A2-細(xì)胞內(nèi)雖然也存在let-7，但是T29A2-細(xì)胞過度表達(dá)的是無3'UTR區(qū)域的HMGA2蛋白，let-7無作用靶點，從而解釋了T29A2+細(xì)胞中的HMGA2表達(dá)水平低于T29A2-細(xì)胞現(xiàn)象的產(chǎn)生。
　　 2.HMGA2的過度表達(dá)能夠誘

24、導(dǎo)卵巢上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化:
　　 (1)T29A2-和T80A2-細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯多于陰性對照細(xì)胞T29，T80，T29-pB,T80-pB;
　　 (2)T29A2+細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯多于陰性對照細(xì)胞T29，T80，T29-pB，T80-pB;
　　 (3)T29A2+細(xì)胞形成的克隆數(shù)目是T29A2-細(xì)胞的一半，表明細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性的let-7，且內(nèi)源性的let-7對T29A2+細(xì)胞內(nèi)的HMGA2表達(dá)

25、有抑制作用。
　　 3.HMGA2的過度表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移:
　　 T29A2-和T80A2-細(xì)胞穿過Matrigel膜的數(shù)目明顯多于陰性對照細(xì)胞T29和T80。
　　 4.HMGA2的過度表達(dá)能促使卵巢上皮細(xì)胞的耐藥性增強:
　　 當(dāng)在細(xì)胞中使用紫杉醇或順鉑后，T29A2-細(xì)胞的存活率明顯高于陰性對照細(xì)胞T29。
　　 5.HMGA2的過度表達(dá)能夠使卵巢上皮細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力

26、增加，能夠使皮下腫瘤組織具有臨床卵巢癌組織病理特征，并且具有EMT傾向:
　　 (1)T29A2-和T80A2-細(xì)胞的成瘤率明顯高于陰性對照細(xì)胞T29和T80;
　　 (2)T29A2-和T80A2-細(xì)胞所形成瘤組織具有卵巢癌組織病理特征，并且具有EMT傾向。
　　 60HMGA2的表達(dá)與EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達(dá)密切相關(guān):
　　 (1)Vimen

27、tin和N-cadherin在T29A2-和T80A2-細(xì)胞中的表達(dá)明顯要高于陰性對照細(xì)胞T29和T80;
　　 (2)Vimentin和N-cadherin在SKOV3-shHMGA2細(xì)胞中的表達(dá)明顯要低于陰性對照細(xì)胞SKOV3-pGIPZ;
　　 (3)E-cadherin在T29A2-和T80A2-細(xì)胞中的表達(dá)明顯要低于陰性對照細(xì)胞T29和T80;
　　 (4)E-cadherin在SKOV3-shHMGA

28、2細(xì)胞中的表達(dá)明顯要高于陰性對照細(xì)SKOV3-pGIPZ。
　　 在第一部分，我們第一次建立了HMGA2過度表達(dá)的卵巢上皮細(xì)胞生物模型，并驗證了HMGA2的過度表達(dá)能夠誘導(dǎo)卵巢上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，能夠促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，能夠使卵巢上皮細(xì)胞的耐藥性增強，能夠使裸鼠的皮下成瘤能力顯著增加，并且所形成的皮下腫瘤組織具有明顯的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征，提示HMGA2在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和EMT過程中發(fā)揮著非常重要的作用。
　　

29、 第二部分，干擾HMGA2表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖和細(xì)胞形態(tài)等方面的影響
　　 為了觀察HMGA2的干擾是否能對卵巢癌細(xì)胞的行為學(xué)產(chǎn)生影響，我們首先用多種方式干擾卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的HMGA2表達(dá)，隨后分別利用軟瓊脂克隆形成實驗、Matrigel侵襲實驗、MTS增殖實驗和形態(tài)學(xué)觀察等各種實驗方法對細(xì)胞的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了檢測。
　　 1.多種方式干擾卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的HMG

30、A2表達(dá):
　　 (1)使用HMGA2-siRNA干擾T29A2-和T80A2-細(xì)胞內(nèi)的HMGA2表達(dá);
　　 (2)使用let-7c干擾T29A2+細(xì)胞內(nèi)的HMGA2表達(dá);
　　 (3)使用慢病毒感染的方法，在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中轉(zhuǎn)入pGIPZ-sh-HMGA2，構(gòu)建穩(wěn)定干擾HMGA2表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3-sh-HMGA2。
　　 2.干擾HMGA2的表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞的惡性程度減弱:

31、r>　　 (1)在T29A2-和T80A2-細(xì)胞內(nèi)使用HMGA2-siRNA能夠使克隆形成數(shù)目明顯少于使用對照Block-it(Block-it為對照siRNA);
　　 (2)在T29A2+細(xì)胞內(nèi)使用let-7c能夠使克隆形成數(shù)目明顯少于使用對照Block-it和anti-let-7。
　　 3.干擾HMGA2的表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移:
　　 (1)在T29A2-細(xì)胞內(nèi)使用HMGA2-siRNA能夠

32、使細(xì)胞穿過Matrigel膜的數(shù)目明顯少于使用對照Block-it;
　　 (2)在T29A2+細(xì)胞內(nèi)使用let-7c能夠使細(xì)胞穿過Matrigel膜的數(shù)目明顯少于使用對照Block-it;
　　 (3)SKOV3-sh-HMGA2細(xì)胞穿過Matrigel膜的數(shù)目明顯少于陰性對照細(xì)胞SKOV3-pGIPZ。
　　 4.干擾HMGA2的表達(dá)能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和增殖:
　　 (1)在T29A2-細(xì)胞

33、內(nèi)使用HMGA2-siRNA能夠使細(xì)胞增殖明顯減緩;
　　 (2)在T29A2+細(xì)胞內(nèi)使用let-7c能夠使細(xì)胞增殖明顯減緩;
　　 (3)SKOV3-sh-HMGA2的增殖速率明顯低于對照細(xì)胞SKOV3-pGIPZ。
　　 5.干擾HMGA2的表達(dá)能夠使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化:
　　 相比較于SKOV3-pGIPZ細(xì)胞，HMGA2的穩(wěn)定干擾使SKOV3-sh-HMGA2細(xì)胞發(fā)生了間質(zhì)上皮化的形態(tài)改變。

34、　　 在第二部分，我們使用siRNA，let-7c，sh-HMGA2等不同的方式分別干擾T29A2-T80A2-，T29A2+，SKOV3細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)，并驗證了穩(wěn)定干擾HMGA2的表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力顯著降低，并且能夠使細(xì)胞的形態(tài)從間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)變。從反方面證實了HMGA2在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 第三部分，HMGA2通過在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控Lumican的表達(dá)而促進(jìn)卵巢

35、癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　 為了更好地理解HMGA2蛋白表達(dá)改變所引起第一、第二部分所表述的行為學(xué)改變是由于什么機制所介導(dǎo)的，也為了更好地尋找HMGA2可能存在的靶microRNA和靶基因，我們進(jìn)行了microRNA芯片和基因芯片分析。隨后我們選取了基因芯片中降幅最大的一個基因---Lumican，做了進(jìn)一步的研究。
　　 1.HMGA2的過度表達(dá)能夠引起一系列腫瘤相關(guān)miRNA的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào):
　　 (1)

36、HMGA2的過度表達(dá)能夠使一系列miRNA的表達(dá)超過2倍以上的上調(diào)，包括let-7a,miR-126，let-7c，miR-193b等;
　　 (2)HMGA2的過度表達(dá)能夠使一系列miRNA的表達(dá)超過2倍以上的下調(diào)，包括miR-29b,miR-18a,miR-15a,miR-22。
　　 2.在卵巢癌組織和正常卵巢組織中，HMGA2與miR-29b的表達(dá)呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān):
　　 (1)HMGA2在卵巢癌組織中高表

37、達(dá)，在正常組織中低表達(dá);
　　 (2)miR-29b在卵巢癌組織中低表達(dá)，在正常組織中高表達(dá);
　　 (3)在卵巢癌和正常對照組織中，HMGA2與miR-29b的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　 3.HMGA2的過度表達(dá)能夠引起一系列基因的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào):
　　 (1)有11個基因有超過2倍以上的表達(dá)下調(diào)，包括Lumican，WNT2等;
　　 (2)有25個基因有超過2倍以上的表達(dá)上調(diào)，包括STC2，C

38、A9等。
　　 4.HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Lumican的表達(dá):
　　 (1)在T29/T29A2-，T80/T80A2-這兩組細(xì)胞中，利用WesternBlot的方法發(fā)現(xiàn)，Lumican在T29A2-和T80A2-細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于在對照細(xì)胞T29和T80中的表達(dá);
　　 (2)在293T-pGIPZ/293T-shHMGA2和SKOV3-pGIPZ/SKOV3-shHMGA2這兩對細(xì)胞中，利用RT-P

39、CR的方法發(fā)現(xiàn)，Lumican在293T-shHMGA2和SKOV3-shHMGA2細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在對照細(xì)胞293T-pGIPZ和SKOV3-pGIPZ中的表達(dá);
　　 (3)在6個卵巢癌上皮細(xì)胞(包括T29，T29A2-，T29H,HEY，SKOV3，OVCAR3)中，使用RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)，HMGA2和Lumican的表達(dá)呈現(xiàn)非常良好的負(fù)相關(guān)，即在HMGA2表達(dá)高的細(xì)胞系(T29A2-，HEY，OVCAR3)中，L

40、umican表達(dá)低;在HMGA2表達(dá)低的細(xì)胞系(T29，T29H，SKOV3)中，Lumican表達(dá)高;
　　 (4)利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗發(fā)現(xiàn)，Lumican能夠在轉(zhuǎn)錄水平被HMGA2所負(fù)調(diào)控，兩者的結(jié)合位點位于Lumican上游啟動子區(qū)域的+1至-800bp之間。
　　 5.Lumican的過度表能夠抑制卵巢癌上皮細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移:
　　 (1)為更好地理解Lumican蛋白在卵巢癌中的功能，我們利用逆

41、轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建了Lumican過度表達(dá)的細(xì)胞系HEY-Lumican和空白對照細(xì)胞系HEY-pBabe;
　　 (2)利用Matrigel侵襲實驗，我們發(fā)現(xiàn)HEY-Lumican細(xì)胞穿過Matrigel膜的數(shù)目明顯少于陰性對照細(xì)胞HEY-pBabe。
　　 6.Lumican在高度惡性漿液性卵巢癌組織(HG-PSC)中的表達(dá)明顯低于正常對照組織:
　　 與30例對應(yīng)的卵巢表皮正常組織和30例輸卵管表皮正常

42、組織相比，30例高度惡性漿液性卵巢癌組織中的Lumican的表達(dá)明顯要低。
　　 在第三部分，我們首先利用基因芯片篩選出了HMGA2的一個靶基因Lumican，并且利用RT-PCR、WesternBlot、siRNA、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)等實驗，證實了HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控Lumican的表達(dá)。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法構(gòu)建了Lumican過度表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞系，通過Matrigel侵襲實驗發(fā)現(xiàn)Lumican的過度表達(dá)能

43、夠抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。驗證了HMGA2通過在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控Lumican的表達(dá)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT過程的發(fā)生。
　　 第四部分，HMGA2通過在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控STC2的表達(dá)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲
　　 在進(jìn)行了基因芯片分析之后，我們還選取了其中升幅比較大的一個基因---STC2做了進(jìn)一步的研究。
　　 1.通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，HMGA2的過度表達(dá)能夠使STC2的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)2.03倍。
　

44、　 2.在高度惡性漿液性卵巢癌中，HMGA2與STC2均高表達(dá)，且兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　 3.HMGA2能在轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控STC2的表達(dá):
　　 (1)在T29/T29A2-，T80/T80A2-這兩組細(xì)胞中，利用WesternBlot和RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)，STC2的表達(dá)在T29A2-和T80A2-細(xì)胞中明顯高于在對照細(xì)胞T29和T80中的表達(dá)。
　　 (2)在SKOV3細(xì)胞中，使用siHMGA2或者

45、anti-let-7后發(fā)現(xiàn):
　　 siHMGA2的使用能夠使HMGA2和STC2的表達(dá)均下調(diào);
　　 anti-let-7的使用能夠使HMGA2和STC2的表達(dá)均有明顯的上升。
　　 (3)利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗發(fā)現(xiàn)，HMGA2能夠在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控STC2，兩者的結(jié)合位點位于STC2上游啟動子區(qū)域的-290bp至-647bp之間。
　　 4.在卵巢癌中，穩(wěn)定干擾STC2的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的遷移:

46、
　　 (1)為更好地理解STC2蛋白在卵巢癌中的功能，我們在卵巢癌細(xì)胞系Caov-3中構(gòu)建了穩(wěn)定干擾STC2表達(dá)的細(xì)胞系(Caov-3-sh-STC2)和陰性對照細(xì)胞系(Caov-3-pGPU6)。
　　 (2)利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)在Caov-3細(xì)胞中干擾STC2的表達(dá)能夠使細(xì)胞形態(tài)從間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)變。
　　 (3)利用劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)Caov-3-sh-STC2細(xì)胞的劃痕修復(fù)時間明顯慢于對照細(xì)胞C

47、aov-3-pGPU6。
　　 (4)利用Transwell侵襲實驗，我們發(fā)現(xiàn)Caov-3-sh-STC2穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)目明顯少于對照細(xì)胞Caov-3和Caov-3-pGPU6。
　　 5.穩(wěn)定干擾STC2的表達(dá)能夠使卵巢癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力顯著降低:
　　 (1)Caov-3-sh-STC2細(xì)胞的成瘤率低于對照細(xì)胞Caov-3和Caov-3-pGPU6;
　　 (2)Caov-3-sh-ST

48、C2細(xì)胞的皮下腫瘤生長速率明顯慢于對照細(xì)胞Caov-3和Caov-3-pGPU6。
　　 6.在高度惡性漿液性卵巢癌中，STC2的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān):
　　 最后，我們對95名HG-PSC患者進(jìn)行了生存分析，發(fā)現(xiàn)STC2的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即STC2表達(dá)高的患者，預(yù)后越差，生存時間越短。
　　 在第四部分，我們選取STC2做了進(jìn)一步的研究，隨后利用RT-PCR、WesternBlot、siRNA轉(zhuǎn)染