胰腺癌耐吉西他濱細(xì)胞株的建立、鑒定、蛋白組學(xué)分析及南瓜蛋白對其作用的研究.pdf

1、目的：
　　建立人胰腺癌耐吉西他濱（Gemcitabine，GEM）細(xì)胞株，為研究胰腺癌化療過程中產(chǎn)生獲得性耐藥機制的研究提供細(xì)胞模型；初步探討南瓜蛋白（cucurmosin，CUS）可能的作用機制，并觀察其誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制及逆轉(zhuǎn)耐藥的能力，為CUS潛在的抗胰腺癌作用臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，進(jìn)而為治療胰腺癌提供新方法。
　　方法：
　　1、建立耐藥株：用GEM以濃度梯度遞增誘導(dǎo)法及克隆化培養(yǎng)建立胰腺癌耐GEM細(xì)

2、胞株P(guān)ANC-1RG7。
　　2、鑒定耐藥株：光鏡、電鏡觀察形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)；細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，計算倍增時間；流式細(xì)胞儀（FCM）測定細(xì)胞周期；磺酰羅丹明B（SRB）法檢測GEM、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶呤（MTX）、長春新堿（VCR）、吉非替尼（GEF）、順鉑（DDP）及5–氟尿嘧啶（5-FU）的半數(shù)抑制濃度（IC50），計算耐藥指數(shù)（RI），觀察是否存在交叉耐藥；建立裸鼠皮下種植瘤

3、模型，體內(nèi)觀察GE M的抑制率；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）法及Western blot法檢測已知耐藥相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，如多藥耐藥基因（MDR1）及其蛋白產(chǎn)物P–糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP），及已被認(rèn)為與胰腺癌耐藥相關(guān)的脫氧胞苷激酶（dCK）、脫氧胞苷脫氨酶（CDA）、5’–核苷酸酶（NT5）、平衡型核苷載體（ENT）、核糖核苷酸還原酶（RRM）、DNA聚合酶A（POLA）等；

4、Western blot法檢測細(xì)胞抗凋亡通路PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路靶點PI3K、Akt及mTOR的表達(dá)變化。
　　3、蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析差異蛋白：用相對和絕對定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）技術(shù)初步分析其耐藥細(xì)胞系與親代細(xì)胞系間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，探尋新的可能與耐藥相關(guān)的蛋白。
　　4、CUS機制的初步探索：Wesrten Blot法觀察CUS干預(yù)PANC-1細(xì)胞后表皮生長因子（EGFR）及其下

5、游信號通路各位點的表達(dá)變化，qPCR檢測CUS干預(yù)后EGFR基因表達(dá)的變化。SRB及集落形成實驗觀察CUS與吉非替尼（GEF）聯(lián)合應(yīng)用對PANC-1的作用。
　　5、CUS對耐藥株的作用研究：透射電鏡觀察CUS作用后耐藥細(xì)胞株形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變；FCM測定CUS對耐藥細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響；SRB法觀察CUS單用及與GEM聯(lián)用對耐藥細(xì)胞生長抑制率的影響，觀察協(xié)同作用，計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及相對逆轉(zhuǎn)效率；集落形成實驗觀察CUS與GEM聯(lián)用對

6、耐藥株的作用；建立裸鼠皮下種植瘤模型，體內(nèi)觀察CUS對耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用；Western blot法觀察CUS干預(yù)后耐藥細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1、成功誘導(dǎo)建立人胰腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1RG7細(xì)胞，能夠耐受2μmol/L GEM3天以上，并可正常增殖、傳代；
　　2、PANC-1RG7細(xì)胞具有特殊的形態(tài)學(xué)變化，明顯區(qū)別于親本細(xì)胞；生長明顯緩慢（p<0.05）；細(xì)胞周期無顯著性改變（p>0.05）

7、；對GEM的耐藥指數(shù)達(dá)39.9，并存在對MTX、GEF、DDP及5-FU不同程度的交叉耐藥性；GEM對PANC-1RG7腫瘤的體內(nèi)生長抑制作用明顯減弱（p<0.05）；CDA、MRP及BCRP基因表達(dá)均明顯降低（p<0.05），余檢測基因無顯著變化；NT5、RRM1、RRM2蛋白表達(dá)增高（p<0.05），余檢測蛋白表達(dá)無顯著變化。
　　3、ITRAQ技術(shù)檢測出差異顯著（p<0.05）的蛋白共261個，參與了蛋白折疊、細(xì)胞骨架組裝、

8、翻譯轉(zhuǎn)錄、一些蛋白復(fù)合體的合成和組裝、葡萄糖合成、核苷酸有關(guān)的延伸功能等生物學(xué)過程，涉及多條能量、遺傳物質(zhì)代謝通路及IL22可溶性受體信號通路。
　　4、CUS干預(yù)后，PANC-1細(xì)胞中所檢測的EGFR、Akt、mTOR、PI3K、ras及c-raf的蛋白表達(dá)量均降低，EGFR基因水平表達(dá)無變化。聯(lián)合應(yīng)用低劑量的CUS與GEF長時間干預(yù)PANC-1細(xì)胞顯示出協(xié)同作用。
　　5、電鏡下可見CUS干預(yù)PANC-1RG7細(xì)胞后明顯

9、凋亡改變；FCM檢測細(xì)胞周期無顯著性改變，但可見凋亡峰出現(xiàn)；SRB測得CUS干預(yù)PANC-1及PANC-1RG7細(xì)胞96h的IC50值分別為0.0535±0.0100及0.0318±0.0090μmol/L，GEM與CUS聯(lián)用僅呈單獨相加作用，不存在協(xié)同或拮抗作用；0.007813μmol/L濃度CUS的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)效率分別為1.78±0.65及50.13±16.87％；集落形成實驗觀察GEM與CUS聯(lián)用效應(yīng)也僅呈單獨相加作用；CUS

10、對耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1RG7的體內(nèi)抑制作用較其親本細(xì)胞PANC-1更強；CUS干預(yù)后，RRM1、RRM2、PI3K、Akt及mTOR蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　1、GEM濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立的胰腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)ANC-1RG7具有獨特的形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特點，可能是通過RRM1、RRM2蛋白過表達(dá)而獲得耐藥性的。
　　2、人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1及其耐GEM細(xì)胞株P(guān)ANC-1RG7的表達(dá)差異蛋

11、白共261個，參與了多項生物學(xué)過程，涉及多條能量、遺傳物質(zhì)代謝通路以及IL22可溶性受體信號通路。
　　3、CUS能夠妨礙EGFR下游Ras/Raf通路及PI3K/Akt/mTOR通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　4、CUS能夠增加EGFR靶向藥物GEF的敏感性。
　　5、CUS能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)PANC-1RG7細(xì)胞凋亡，且在體內(nèi)外均可抑制細(xì)胞增殖，其作用較其親本細(xì)胞PANC