吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株SW1990的耐藥作用與硫氧還蛋白還原酶活性改變的觀察.pdf

1、背景：胰腺癌惡性程度高，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，近年來(lái)發(fā)病率逐漸增高?；熢谝认侔┑木C合治療體系中占有非常重要的地位，但遺憾的是大多數(shù)胰腺癌對(duì)化療并不敏感，還有一些胰腺癌在經(jīng)過(guò)數(shù)次化療后迅速耐藥。近年來(lái)，由于吉西他濱的臨床應(yīng)用，對(duì)胰腺癌的化療效果有所改善，但總的來(lái)說(shuō)，化療的效果并不令人滿意。所以，對(duì)胰腺癌的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究就顯得極為重要。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)胰腺癌細(xì)胞的原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥機(jī)制進(jìn)行了許多研究，并分別以5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿

2、霉素(ADM)成功誘導(dǎo)了相關(guān)的人胰腺癌耐藥細(xì)胞株。本研究擬進(jìn)一步選取目前治療胰腺癌的一線藥物吉西他濱，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株SW1990建立胰腺癌的吉西他濱耐藥細(xì)胞株，并對(duì)比觀察耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特征的變化。 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，利用基因芯片技術(shù)，對(duì)比分析了人胰腺癌細(xì)胞株SW1990與藥物誘導(dǎo)建立的耐5-Fu的細(xì)胞株SW1990/Fu及耐ADM的細(xì)胞株SW1990/ADM的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)后二者的硫氧還蛋白還原酶

3、基因表達(dá)明顯增高。已知硫氧還蛋白還原酶(thioredoxinreductase，TrxR)具有廣泛的底物特性，在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)參與下調(diào)節(jié)多種底物的氧化還原反應(yīng)，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要作用。硫氧還蛋白系統(tǒng)不僅在細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥方面亦發(fā)揮重要作用，目前認(rèn)為T(mén)rxR是潛在的抗癌藥物分子靶標(biāo)。RNA干擾現(xiàn)象(RNAinterference，RNAi)——最早發(fā)現(xiàn)于對(duì)

4、線蟲(chóng)的研究，能高效特異地阻斷基因的表達(dá)，近來(lái)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，取得了較好的效果。本研究利用這一技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成抑制TrxR基因表達(dá)的RNAi片段，載入真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以期在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中，雙鏈RNA能夠長(zhǎng)期發(fā)揮阻斷該基因的作用，抑制TrxR的生成，降低TrxR的活性。本實(shí)驗(yàn)期望通過(guò)檢測(cè)并對(duì)比SW1990親本細(xì)胞和吉西他濱、5-氟尿嘧啶及阿霉素誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞的TrxR活性變化，以確定TrxR在耐藥機(jī)制中的作用

5、，并進(jìn)一步檢測(cè)通過(guò)RNAi抑制了TrxR活性的細(xì)胞對(duì)相應(yīng)化療藥物的反應(yīng)，以期證實(shí)TrxR在細(xì)胞耐藥機(jī)制中的作用。 方法：1、采用間歇濃度梯度倍增法誘導(dǎo)建立胰腺癌耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ；2、通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)比觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定和對(duì)比觀察細(xì)胞倍增時(shí)間的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定和對(duì)比細(xì)胞周期的變化；3、應(yīng)用四唑鹽比色法藥物殺傷實(shí)驗(yàn)(MTT)法檢測(cè)親本細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性變化；4、

6、通過(guò)測(cè)定TrxR的底物DTNB減少的速率來(lái)測(cè)定和對(duì)比親本細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株的TrxR的活性變化；5、應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制耐藥細(xì)胞株的TrxR的基因表達(dá)、調(diào)控改變其活性，并以MTT法檢測(cè)抑制前后各細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性變化。 結(jié)果和討論：1、經(jīng)過(guò)9個(gè)月的藥物培養(yǎng)后，得到了穩(wěn)定傳代的SW1990/GZ耐藥細(xì)胞株；其形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特征等均發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞變圓、體積縮小、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、顆粒樣物質(zhì)增多及細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)；SW1990/G

7、Z的倍增時(shí)間(29h)長(zhǎng)于SW1990(22h)。2、應(yīng)用MTT法檢測(cè)親本細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ較親本細(xì)胞株SW1990對(duì)4種化療藥物均顯示出耐藥性顯著增高，二者對(duì)吉西他濱的耐藥性差異高達(dá)509倍。3、對(duì)親本細(xì)胞株和各耐藥細(xì)胞亞系的TrxR活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞的TrxR活性明顯高于SW1990細(xì)胞；各耐藥細(xì)胞之間，TrxR活性也有差異。4、將含有設(shè)定不同序列的RNAi片斷的質(zhì)粒(片段

8、1、2、3、4和D，片段D為對(duì)照片段)，分別轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞和SW1990/GZ細(xì)胞，檢測(cè)TrxR活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：a、耐藥細(xì)胞株細(xì)胞SW1990/GZ與親本細(xì)胞株細(xì)胞SW1990，轉(zhuǎn)染對(duì)照片斷后，TrxR活性均無(wú)明顯差異，說(shuō)明對(duì)照質(zhì)粒對(duì)TrxR活性無(wú)顯著影響；b、設(shè)定片段2經(jīng)多次轉(zhuǎn)染不能成功；c、SW1990/GZ與SW1990，轉(zhuǎn)染設(shè)定片斷1和片斷3后，TrxR活性變化均無(wú)明顯差異，說(shuō)明這兩個(gè)設(shè)定片斷未能起到RNAi作用，為不合適

9、片斷；d、SW1990/GZ與SW1990，轉(zhuǎn)染設(shè)定片斷4后，TrxR活性均明顯降低，且對(duì)4種化療藥物的耐藥性有不同程度的降低，對(duì)吉西他濱的耐藥性降低最為顯著，說(shuō)明該片斷為合適片斷，能干擾抑制TrxR的基因表達(dá)，降低其活性，并且證實(shí)了TrxR的活性改變與化療的耐藥性相關(guān)。 綜上所述，本論文的發(fā)現(xiàn)及結(jié)論為：1、體外濃度梯度遞增法能夠建立穩(wěn)定傳代的胰腺癌耐藥細(xì)胞株，依此本論文首先建立了對(duì)吉西他濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞株SW1990/GZ；

10、 2、建立的耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ除了對(duì)吉西他濱耐藥以外，還對(duì)其他藥物具有不同程度的耐藥，表現(xiàn)出多藥耐藥現(xiàn)象； 3、TrxR的活性在各耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ、SW1990/ADM及SW1990/Fu中均增高，因此，TrxR活性增高可能是胰腺癌細(xì)胞株耐化療藥物的普遍作用機(jī)制之一； 4、選取合適的RNAi片段(RNAi片斷4)，通過(guò)RNAi技術(shù)可以部分抑制TrxR的活性，并由此可以降低胰腺癌細(xì)胞的耐藥性，

11、證明TrxR在胰腺癌細(xì)胞株耐藥中的作用。 以上結(jié)果顯示化療可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞繼發(fā)性耐藥，因此，胰腺癌首選化療方案的制定對(duì)于化療療效有著重要影響。利用RNAi技術(shù)抑制TrxR的活性可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞株對(duì)化療藥物的耐藥作用，有必要在TrxR誘發(fā)耐藥的作用及機(jī)理方面進(jìn)一步研究，并結(jié)合RNAi技術(shù)進(jìn)一步探索治療胰腺癌的新方法和新藥物。 InducedDrugResistanceandExploredtheChangesoftheA