吉西他濱誘導胰腺癌細胞株SW1990的耐藥作用與硫氧還蛋白還原酶活性改變的觀察.pdf

1、背景：胰腺癌惡性程度高，手術切除率低，術后復發(fā)率高，近年來發(fā)病率逐漸增高。化療在胰腺癌的綜合治療體系中占有非常重要的地位，但遺憾的是大多數(shù)胰腺癌對化療并不敏感，還有一些胰腺癌在經(jīng)過數(shù)次化療后迅速耐藥。近年來，由于吉西他濱的臨床應用，對胰腺癌的化療效果有所改善，但總的來說，化療的效果并不令人滿意。所以，對胰腺癌的耐藥機制進行研究就顯得極為重要。本實驗室對胰腺癌細胞的原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥機制進行了許多研究，并分別以5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿

2、霉素(ADM)成功誘導了相關的人胰腺癌耐藥細胞株。本研究擬進一步選取目前治療胰腺癌的一線藥物吉西他濱，誘導胰腺癌細胞株SW1990建立胰腺癌的吉西他濱耐藥細胞株，并對比觀察耐藥細胞和親本細胞株的形態(tài)學、生長特征的變化。 在本實驗室的前期工作中，利用基因芯片技術，對比分析了人胰腺癌細胞株SW1990與藥物誘導建立的耐5-Fu的細胞株SW1990/Fu及耐ADM的細胞株SW1990/ADM的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)后二者的硫氧還蛋白還原酶

3、基因表達明顯增高。已知硫氧還蛋白還原酶(thioredoxinreductase，TrxR)具有廣泛的底物特性，在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)參與下調(diào)節(jié)多種底物的氧化還原反應，在氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御中起重要作用。硫氧還蛋白系統(tǒng)不僅在細胞的增殖和生長過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥方面亦發(fā)揮重要作用，目前認為TrxR是潛在的抗癌藥物分子靶標。RNA干擾現(xiàn)象(RNAinterference，RNAi)——最早發(fā)現(xiàn)于對

4、線蟲的研究，能高效特異地阻斷基因的表達，近來被廣泛應用于細胞分子生物學實驗中，取得了較好的效果。本研究利用這一技術，設計并合成抑制TrxR基因表達的RNAi片段，載入真核細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，以期在長期穩(wěn)定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發(fā)揮阻斷該基因的作用，抑制TrxR的生成，降低TrxR的活性。本實驗期望通過檢測并對比SW1990親本細胞和吉西他濱、5-氟尿嘧啶及阿霉素誘導的耐藥細胞的TrxR活性變化，以確定TrxR在耐藥機制中的作用

5、，并進一步檢測通過RNAi抑制了TrxR活性的細胞對相應化療藥物的反應，以期證實TrxR在細胞耐藥機制中的作用。 方法：1、采用間歇濃度梯度倍增法誘導建立胰腺癌耐藥細胞株SW1990/GZ；2、通過光學顯微鏡和電子顯微鏡對比觀察細胞的形態(tài)學變化；采用細胞計數(shù)法測定和對比觀察細胞倍增時間的變化；應用流式細胞儀測定和對比細胞周期的變化；3、應用四唑鹽比色法藥物殺傷實驗(MTT)法檢測親本細胞株和耐藥細胞株對化療藥物的敏感性變化；4、

6、通過測定TrxR的底物DTNB減少的速率來測定和對比親本細胞株和耐藥細胞株的TrxR的活性變化；5、應用RNAi技術抑制耐藥細胞株的TrxR的基因表達、調(diào)控改變其活性，并以MTT法檢測抑制前后各細胞株對化療藥物的敏感性變化。 結果和討論：1、經(jīng)過9個月的藥物培養(yǎng)后，得到了穩(wěn)定傳代的SW1990/GZ耐藥細胞株；其形態(tài)學、生長特征等均發(fā)生了明顯變化，細胞變圓、體積縮小、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、顆粒樣物質(zhì)增多及細胞倍增時間延長；SW1990/G

7、Z的倍增時間(29h)長于SW1990(22h)。2、應用MTT法檢測親本細胞株和耐藥細胞株對化療藥物的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株SW1990/GZ較親本細胞株SW1990對4種化療藥物均顯示出耐藥性顯著增高，二者對吉西他濱的耐藥性差異高達509倍。3、對親本細胞株和各耐藥細胞亞系的TrxR活性檢測發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞的TrxR活性明顯高于SW1990細胞；各耐藥細胞之間，TrxR活性也有差異。4、將含有設定不同序列的RNAi片斷的質(zhì)粒(片段

8、1、2、3、4和D，片段D為對照片段)，分別轉(zhuǎn)染SW1990細胞和SW1990/GZ細胞，檢測TrxR活性，結果發(fā)現(xiàn)：a、耐藥細胞株細胞SW1990/GZ與親本細胞株細胞SW1990，轉(zhuǎn)染對照片斷后，TrxR活性均無明顯差異，說明對照質(zhì)粒對TrxR活性無顯著影響；b、設定片段2經(jīng)多次轉(zhuǎn)染不能成功；c、SW1990/GZ與SW1990，轉(zhuǎn)染設定片斷1和片斷3后，TrxR活性變化均無明顯差異，說明這兩個設定片斷未能起到RNAi作用，為不合適

9、片斷；d、SW1990/GZ與SW1990，轉(zhuǎn)染設定片斷4后，TrxR活性均明顯降低，且對4種化療藥物的耐藥性有不同程度的降低，對吉西他濱的耐藥性降低最為顯著，說明該片斷為合適片斷，能干擾抑制TrxR的基因表達，降低其活性，并且證實了TrxR的活性改變與化療的耐藥性相關。 綜上所述，本論文的發(fā)現(xiàn)及結論為：1、體外濃度梯度遞增法能夠建立穩(wěn)定傳代的胰腺癌耐藥細胞株，依此本論文首先建立了對吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞株SW1990/GZ；

10、 2、建立的耐藥細胞株SW1990/GZ除了對吉西他濱耐藥以外，還對其他藥物具有不同程度的耐藥，表現(xiàn)出多藥耐藥現(xiàn)象； 3、TrxR的活性在各耐藥細胞株SW1990/GZ、SW1990/ADM及SW1990/Fu中均增高，因此，TrxR活性增高可能是胰腺癌細胞株耐化療藥物的普遍作用機制之一； 4、選取合適的RNAi片段(RNAi片斷4)，通過RNAi技術可以部分抑制TrxR的活性，并由此可以降低胰腺癌細胞的耐藥性，

11、證明TrxR在胰腺癌細胞株耐藥中的作用。 以上結果顯示化療可以誘導胰腺癌細胞繼發(fā)性耐藥，因此，胰腺癌首選化療方案的制定對于化療療效有著重要影響。利用RNAi技術抑制TrxR的活性可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞株對化療藥物的耐藥作用，有必要在TrxR誘發(fā)耐藥的作用及機理方面進一步研究，并結合RNAi技術進一步探索治療胰腺癌的新方法和新藥物。 InducedDrugResistanceandExploredtheChangesoftheA