HIV-1 gp120對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、I型人類免疫缺陷病毒引起的獲得性免疫缺陷綜合征，即艾滋病，是一種致命性的傳染病，艾滋病具有多項(xiàng)合并癥，大約50-75％的艾滋病感染者合并有眼部并發(fā)癥，尸檢證實(shí)眼底微血管病變發(fā)病率可高達(dá)89％。AIDS視網(wǎng)膜病，又稱HIV視網(wǎng)膜病/非感染性HIV視網(wǎng)膜病，疾病發(fā)生早、累及人群廣泛。病理特點(diǎn)表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管滲漏、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞喪失，神經(jīng)纖維層變薄，臨床檢測(cè)視功能的損害往往先于患者自覺癥狀出現(xiàn)之前。目前治療以全身抗艾治療結(jié)合局部手術(shù)治療為主，臨

2、床療效不理想，盡管學(xué)者們公認(rèn)AIDS視網(wǎng)膜病的發(fā)病基礎(chǔ)是HTV造成的血-視網(wǎng)膜屏障崩潰，但其具體發(fā)病機(jī)理并不明確，對(duì)AIDS視網(wǎng)膜病發(fā)病機(jī)制的探索將有利于臨床診治工作的有效開展。 HIV-1包膜蛋白gp120在病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵犯機(jī)制中的作用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道。首先，病毒表面的結(jié)合態(tài)gp120在介導(dǎo)HIV對(duì)宿主細(xì)胞的結(jié)合中具有關(guān)鍵作用，其次，自感染細(xì)胞釋放的游離態(tài)gp120的細(xì)胞毒性同樣不容忽視。如gp120誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)

3、炎癥介質(zhì)釋放、細(xì)胞凋亡，細(xì)胞間緊密連接破壞等等。在視網(wǎng)膜疾病的研究中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有重要地位。RPE及其細(xì)胞間緊密連接不但形成基底膜-Brush膜-脈絡(luò)膜復(fù)合體，參與構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障，細(xì)胞內(nèi)還含有多種抗氧化劑，包括水溶性代謝物和酶如酸性維生素C，脂溶性物質(zhì)如維生素E、黑色素等，是抗氧化作用的重要場(chǎng)所。此外，RPE細(xì)胞能特異性地吞噬感光細(xì)胞的外節(jié)段，這對(duì)于視細(xì)胞外節(jié)更新和正常視覺功能的維持具有重要意義。遺憾的是，國際上目前有關(guān)A

4、IDS視網(wǎng)膜并發(fā)癥的研究中，gp120是否導(dǎo)致RPE細(xì)胞病理改變及其發(fā)病機(jī)制的報(bào)道相當(dāng)缺乏。 本研究首次從分子水平探討gp120對(duì)RPE細(xì)胞的功能影響及其作用環(huán)節(jié)，預(yù)期研究結(jié)果可能為HIV眼部感染的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題從以下四個(gè)方面入手： 一、gp120體外對(duì)RPE細(xì)胞增殖和凋亡的影響 1.目的：探討體外實(shí)驗(yàn)中g(shù)p120對(duì)RPE細(xì)胞的生長增殖及凋亡的影響，以及細(xì)胞株D407有關(guān)CD4，CXCR4，CCR

5、5受體表達(dá)的免疫化學(xué)特征。 2.研究方法： 2.1RPE細(xì)胞的免疫化學(xué)特征 培養(yǎng)RPE原代細(xì)胞與細(xì)胞株D407，用免疫組織化學(xué)的方法鑒定原代細(xì)胞角蛋白染色，以及細(xì)胞株D407有關(guān)CD4，CXCR4，CCR5的表達(dá)； 2.2gp120對(duì)RPE細(xì)胞增殖和凋亡的影響 使用4-6代的原代細(xì)胞和D407細(xì)胞株，首先檢測(cè)在96孔板不同密度種植的細(xì)胞第24小時(shí)的生長曲線，并選擇3000細(xì)胞/孔為生長抑制實(shí)驗(yàn)的種

6、植密度。用MTT法檢測(cè)不同濃度的gp120分別作用RPE細(xì)胞24小時(shí)，48小時(shí)以及72小時(shí)的生長率。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)0.1μg/ml的gp120處理RPE細(xì)胞24、48和72小時(shí)后的凋亡率。 2.3透射電鏡觀察gp120對(duì)D-407細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 采用透射電鏡的方法，觀察經(jīng)0.1μg/ml的gp120處理后的D407細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。 3.研究結(jié)果： 3.1D407細(xì)胞株免疫細(xì)胞染色CD4受體為

7、陰性，CXCR4及CCR5受體為陽性，在細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞膜上均有分布。HIV-Igp120對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能影響及其分子機(jī)制的研究. 3.2MTT細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀凋亡率檢測(cè)結(jié)果：第48，72小時(shí)處理組自gp120濃度0.004μg/ml起，對(duì)RPE細(xì)胞株D-407及原代細(xì)胞的生長率有輕微的抑制作用；第48小時(shí)最大抑制率為20％。經(jīng)0.1μg/ml的gp120處理不同時(shí)間的RPE細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率有顯著性差異變化

8、。 3.3透射電鏡發(fā)現(xiàn)經(jīng)gp120處理后的D407細(xì)胞出現(xiàn)了線粒體腫脹、溶酶體增多以及早期凋亡的表現(xiàn)。 4.結(jié)論： RPE細(xì)胞可表達(dá)輔助受體CXCR4和CCR5。高濃度的gp120自第48小時(shí)開始對(duì)RPE細(xì)胞的生長具有抑制作用，而沒有顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，但電鏡下超微結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞器損害的表現(xiàn)。 二、gp120對(duì)D407細(xì)胞影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 1.目的： 比較gp120處理前后D407細(xì)

9、胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，從整體的蛋白質(zhì)水平對(duì)gp120影響D407細(xì)胞的分子機(jī)理進(jìn)行初步探索并提供線索。 2.研究方法： 0.1μg/ml的gp120處理體外培養(yǎng)的D407細(xì)胞，利用雙向凝膠電泳分離處理前后細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，建立雙向凝膠電泳圖譜，圖像分析選取部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析獲取肽質(zhì)量指紋圖譜，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。 3.研究結(jié)果： 得到分辨率和重復(fù)性較好

10、的gp120處理前后D407細(xì)胞雙向凝膠電泳圖譜，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)11個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜，主要為：1、核糖核蛋白體家族；2、氧化應(yīng)激相關(guān)酶，如SOD-Mn；3、其他，如核纖層蛋白，鈣調(diào)節(jié)蛋白等。 4.結(jié)論： Gp120對(duì)D407的影響可能涉及細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架構(gòu)建等方面。 三、gp120對(duì)D407細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 1.目的： 觀察gp120對(duì)體外培養(yǎng)的D

11、407細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響，測(cè)定各種氧化應(yīng)激酶活性的變化，以及對(duì)一氧化氮合酶和II型超氧化物歧化酶表達(dá)的影響。 2.研究方法： 2.1測(cè)定氧化應(yīng)激酶活性的變化。分別對(duì)gp120的不同濃度組和不同處理時(shí)間組的D407細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。取細(xì)胞勻漿檢測(cè)一氧化氮，丙二醛和總抗氧能力的變化。 2.2采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，檢測(cè)0.1μg/mlgp120處理D407細(xì)胞48小時(shí)后，誘導(dǎo)型一氧化氮酶在細(xì)胞表達(dá)的變化。 2.

12、3檢測(cè)iNOS在D407細(xì)胞在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。采用SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)iNOSmRNA。 2.4使用WesternBlot檢測(cè)gp120不同濃度和不同時(shí)間處理組的D407細(xì)胞在iNOS和SOD-Mn蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。 3.研究結(jié)果： 3.1gp120導(dǎo)致細(xì)胞T-AOC降低，NO和MDA增加，其中NO在第48小時(shí)測(cè)定最高值，具有劑量依賴性；T-AOC和MDA變化趨勢(shì)均具有

13、時(shí)間、劑量依賴性。 3.2未處理的D407細(xì)胞iNOS表達(dá)呈陰性，處理后部分在細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜有陽性表達(dá)。 3.3隨著gp120濃度的增加，D407細(xì)胞的iNOSmRNA表達(dá)量增加，具有劑量依賴性。差異具顯著性。 3.4WesternBlot結(jié)果顯示，gp120導(dǎo)致D407細(xì)胞中iNOS及SOD-Mn蛋白表達(dá)量均增加，呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性。 4.結(jié)論： Gp120導(dǎo)致D407細(xì)胞氧化應(yīng)激，自

14、由基生成增多、抗氧化能力下降，iNOS及SOD-Mn表達(dá)增加。 四、gp120對(duì)D407細(xì)胞間緊密連接的影響 1.目的：研究gp120對(duì)體內(nèi)視網(wǎng)膜屏障功能以及體外培養(yǎng)D407細(xì)胞緊密連結(jié)功能和結(jié)構(gòu)的影響。 2.研究方法： 2.1觀察gp120對(duì)大鼠視網(wǎng)膜通透性的影響。使用SD大鼠，玻璃體腔注射2μg/1μlPBS的gp120，對(duì)照組為熱滅活蛋白。24小時(shí)后股靜脈注射伊文氏藍(lán)，循環(huán)2-3小時(shí)后行心臟灌注，視

15、網(wǎng)膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察染料的滲透。 2.2建立視網(wǎng)膜外屏障體外模型，觀察不同濃度組和不同時(shí)間組的gp120對(duì)體外D407細(xì)胞的跨上皮細(xì)胞電阻和FITC-白蛋白的通透率的影響。 2.3使用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)三種緊密連接蛋白在D407細(xì)胞的表達(dá)。透射電鏡觀察gp120處理后細(xì)胞間緊密連接在超微結(jié)構(gòu)水平的改變。 2.4使用WesternBlot檢測(cè)gp120不同濃度和不同時(shí)間處理組的D407細(xì)胞的三種緊密連接蛋白

16、在蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。 3、研究結(jié)果： 3.1大鼠玻璃體內(nèi)注射活性gp12024小時(shí)后，視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)染料滲漏，視網(wǎng)膜組織間出現(xiàn)了多數(shù)點(diǎn)狀高熒光的染料表達(dá)。 3.2gp120可導(dǎo)致D407細(xì)胞TER水平降低，單層D407細(xì)胞滲透率增加，具有時(shí)間、劑量依賴性。在由低到高gp120的不同濃度組，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.3免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)三種緊密連接蛋白在D407細(xì)胞的胞膜、胞漿均有表達(dá)。透射電鏡觀

17、察gp120處理后細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)較對(duì)照組減少。 3.4WesternBlot檢測(cè)gp120下調(diào)了D407細(xì)胞ZO-1和Claudin-1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，具有時(shí)間和劑量依賴性。對(duì)Occludin沒有觀察到明顯的抑制效應(yīng)。 4.結(jié)論： HIV-1gp120導(dǎo)致視網(wǎng)膜屏障功能損害，其損害機(jī)制與RPE細(xì)胞間緊密連接破壞有關(guān)，具體表現(xiàn)在：體外培養(yǎng)的D407跨上皮細(xì)胞電阻下降，對(duì)白蛋白通透率增加，緊密連接蛋白水平下調(diào)