鸚鵡熱嗜衣原體禽鳥株的分離、鑒定與基因分型.pdf

1、目的：優(yōu)化鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，C.psittaci，Cps）禽鳥株分離鑒定培養(yǎng)技術(shù)，通過測(cè)序及進(jìn)化樹分析ompA基因的多態(tài)性，研究Cps的種系發(fā)育史及獲得可靠Cps感染的流行病學(xué)資料，掌握衡陽地區(qū)Cps的流行病學(xué)特征，從而為Cps感染的預(yù)防、診斷、治療措施提供依據(jù)。
　　方法：收集衡陽地區(qū)可疑的禽鳥標(biāo)本，利用分子生物學(xué)技術(shù)，提取禽鳥肝組織全基因組DNA，設(shè)計(jì)MOMP特異性引物，PCR擴(kuò)增約

2、264bp的基因片段，用1.7％瓊脂糖凝膠電泳分離。將PCR陽性禽鳥標(biāo)本肝組織勻漿液接種到單層敏感細(xì)胞株人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2）細(xì)胞和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)中培養(yǎng)，免疫熒光染色法（IF）鑒定Cps包涵體，免疫熒光顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞內(nèi)包涵體形態(tài)的變化。按照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)另一對(duì)MOMP特異性引物，PCR擴(kuò)增約1000bp的基因片段，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)從Genebank中獲得

3、Cps各型參考株的ompA基因序列，利用軟件ClustalX2和MEGA3構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析臨床株與各參考株之間的親緣關(guān)系。通過BLAST分析8例標(biāo)本基因間的相似性。
　　結(jié)果：
　　通過 PCR擴(kuò)增及測(cè)序的方法從591例禽鳥標(biāo)本（其中鸚鵡425只，鴿子23只及其它類型禽鳥143只）中檢測(cè)到8例陽性，其中7例來源于鸚鵡，染率約為1.64%，1例來源于相思鳥。鴿子的染率為0%，其它類型禽鳥的染率約為0.69%；8例陽性標(biāo)本在H

4、ep-2及Vero細(xì)胞中成功培養(yǎng)出7株，成功率為87.5%；通過Cps在Hep-2細(xì)胞與Vero細(xì)胞中培養(yǎng)生長(zhǎng)情況的比較，發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞在原代培養(yǎng)時(shí)其胞內(nèi)包涵體形成單位（IFU）數(shù)量大于 Vero細(xì)胞，培養(yǎng)三代后免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Vero細(xì)胞內(nèi)的IFU數(shù)量較Hep-2細(xì)胞大；對(duì)8例陽性禽鳥標(biāo)本PCR產(chǎn)物ompA基因序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Cps各型參考株ompA序列進(jìn)行軟件分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其中7例為A型，另外一例暫未能分型；將8

5、例陽性禽鳥標(biāo)本PCR產(chǎn)物ompA基因序列與C. psittaci6BC標(biāo)準(zhǔn)株ompA基因進(jìn)行BLAST分析，Cps6BC與其中7例的相似度在92%～99%之間，另外一例與Cps6BC的相似度僅為58%；將E9的ompA基因與Genebank中其它已知菌株基因進(jìn)行比對(duì)也未能對(duì)其進(jìn)行確定。
　　結(jié)論：
　?。?）成功分離Cps禽鳥株7株，并完善了Cps陽性禽鳥株分離鑒定培養(yǎng)技術(shù)；
　?。?）衡陽地區(qū)Cps可能主要以鸚鵡為其