EMD-621和N-去甲基克拉霉素誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡機制研究.pdf

1、EMD-621為人工合成的結(jié)構(gòu)新化合物,本文首次對其體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了較為系統(tǒng)的研究,主要探討了EMD-621在兩種腫瘤細胞:人胃腺癌SGC-7901細胞、人宮頸癌HeLa細胞誘導(dǎo)細胞凋亡的機制；另外還研究了N-去甲基克拉霉素誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的機制。
　　 體內(nèi)實驗結(jié)果表明,EMD-621對荷S180的昆明種小鼠移植腫瘤有一定的抑制作用；體外實驗結(jié)果表明,EMD-621對人宮頸癌(HeLa),人乳腺癌(MCF-7),人胃

2、腺癌(SGC-7901),人慢性骨髓性白血病細胞(K562)均有明顯的細胞毒作用。EMD-621對小鼠成纖維細胞(3T3)也有一定的細胞毒作用,但在等劑量下其毒性遠低于順鉑。
　　 用形態(tài)學(xué)方法、核熒光染色、DNA片段化分析、LDH活力測定、細胞周期分布分析及Annexin V-FITC檢測磷脂酰絲氨酸(PS)外翻實驗充分證實了EMD-621誘導(dǎo)HeLa和SGC-7901細胞死亡機制為細胞凋亡。
　　 3.4μmol·L

3、-1EMD-621作用于HeLa細胞后,半胱氨酸天冬氨酸酶-3(cysteinylaspirate specific proteinase-3,caspase-3)和-8的酶原被降解,caspase家族抑制劑、caspase-1、-3和-8的抑制劑可部分抑制細胞死亡,caspase-10抑制劑幾乎沒有作用,而caspase-9抑制劑則增加了細胞死亡率。Caspase-3底物caspase-3依賴型的DNA酶抑制物(inhibitor o

4、f caspase activated DNase,ICAD)和多聚腺苷二磷酸聚合酶(poly-(ADP-ribose)polymerase,PARP)降解,表明EMD-621誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡時激活了caspase級聯(lián)反應(yīng),但是caspase-9沒有參與其中；死亡受體的配體FasL表達增加,推測EMD-621可能同時誘導(dǎo)FADD(Fas-associated protein with deathdomain)的表達,激活了下游的ca

5、spase途徑；促凋亡蛋白Bax(Bcl-2 associated Xprotein)表達增加,抑凋亡蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-leukemia-2 gene,Bcl-2)表達降低,Bax/Bcl-2表達的比率在藥物作用12h后隨時間延長而升高,羅丹明123(rhodamine123)染色可見線粒體膜電位下降,表明EMD-621誘導(dǎo)細胞凋亡時激活以線粒體為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細胞凋亡早期p21水平短暫升高,但此后很

6、快被降解；藥物作用12 h后即可見p53表達增加,并且其表達強度逐漸增加；抗凋亡蛋白SIRT1的表達隨著藥物作用時間的延長而降低；p38抑制劑SB203580降低細胞的死亡率,細胞外信號調(diào)控的蛋白激酶(extracellularsignal-regulated proteinkinase,ERK)抑制劑PD98059增加細胞的死亡率,c-Jun N末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)抑制劑SP600125對細

7、胞沒有作用；ERK在12 h時被抑制,p38在12 h時被激活,表明p38發(fā)揮了促進細胞凋亡的作用而ERK發(fā)揮了促進細胞增殖的作用。
　　 EMD-621作用HeLa細胞24 h,下調(diào)了Ser/Thr激酶Akt的表達,p-Akt先增加后降低,表明Akt參與了EMD-621誘導(dǎo)的HeLa凋亡。蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)家族成員在EMD-621誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡過程起到促細胞增殖作用。PI3K(phosp

8、hatidylinositol3-kinase)抑制劑wortmannin和PKC家族抑制劑staurosporine均更為顯著地增加了EMD-621對ERK蛋白表達及其磷酸化的抑制。以上結(jié)果提示我們在HeLa細胞中,ERK對細胞的保護作用可能是依賴上游的PI3K和PKC途徑實現(xiàn)的。wortmannin和staurosporine增加了EMD-621對SIRT1表達的抑制,表明SIRT1的失活可能受PI3K家族不同成員以及PKC不同亞型

9、的調(diào)控。
　　 核內(nèi)因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制劑PDTC和蛋白消化體(proteasome)抑制劑MG132,增加了細胞的死亡率,同時IκBα也隨藥物作用時間的延長而被降解,說明NF-κB可能在EMD-621誘導(dǎo)HeLa胞凋亡過程中發(fā)揮作用。酪氨酸激酶在EMD-621誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡過程起到促細胞增殖作用。
　　 1.6μmol·L-1EMD-621作用于SGC-7901細胞12

10、h后,caspase-3酶原被降解,同時ICAD和PARP降解,caspase家族抑制劑、caspase-1、-3和-10的抑制劑可部分增加細胞死亡,而caspase-8抑制劑卻顯著降低了SGC-7901細胞對藥物的敏感性,caspase-9抑制劑幾乎沒有作用,表明EMD-621誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡時caspase家族成員起到保護細胞作用。采用ORAC方法考察了EMD-621對活性氧清除的影響,結(jié)果提示EMD-621幾乎無清除活

11、性氧的能力。加入caspase家族抑制劑后,免疫印跡結(jié)果顯示PARP仍被降解,進一步證明存在caspase非依賴性蛋白降解了PARP；FasL的表達先短暫增加而后減少,而FADD表達呈時間依賴性減少,推測很可能存在新的作用靶點；藥物作用12 h后Bax表達顯著升高,Bcl-2表達顯著下降,細胞色素c的釋放也隨著藥物作用時間的延長而增加,rhodamine123染色可觀察到線粒體膜電位下降,表明EMD-621通過改變Bax/Bcl-2的表

12、達,激活以線粒體為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)細胞凋亡。藥物作用12 h后p53表達水平升高,SIRT1表達下調(diào),表明EMD-621能夠下調(diào)SIRT1蛋白,從而促進了p53和Bax上調(diào)。p38、ERK均被激活,p38對凋亡有促進作用,ERK發(fā)揮了促進細胞增殖的作用,而JNK幾乎沒有發(fā)揮作用。
　　 EMD-621作用SGC-7901細胞12 h,下調(diào)了Akt的表達,p-Akt也呈時間依賴性減少,表明Akt參與了EMD-621誘導(dǎo)的S

13、GC-7901凋亡。NF-κB抑制劑PDTC和proteasome抑制劑MG132增加了細胞的死亡率,并且IκBα隨藥物作用時間的延長而被降解,說明NF-κB可能在EMD-621誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡過程中發(fā)揮作用。PKC家族成員以及酪氨酸激酶在EMD-621誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡過程中均起到促細胞增殖作用。
　　 本論文首次發(fā)現(xiàn)N-去甲基克拉霉素具有抗癌活性。60μmol·L-1N-去甲基克拉霉素作用于HeLa細胞

14、,形態(tài)學(xué)方法、核熒光染色、DNA片段化分析、LDH活力測定表明N-去甲基克拉霉素誘導(dǎo)HeLa細胞死亡機制為凋亡。
　　 實驗結(jié)果表明藥物作用后caspase-3酶原被降解,產(chǎn)生有活性的小片段caspase-3,同時ICAD和PARP降解,DNA片段化,caspase家族抑制劑,caspase-3、-9的抑制劑可部分抑制細胞死亡,表明N-去甲基克拉霉誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡時激活了caspase級聯(lián)反應(yīng)。Bax/Bcl-2在藥物作用后

15、隨時間延長而升高,抗凋亡成分Bcl-XL蛋白的表達不受影響,Cyt.c從線粒體釋放到胞漿逐漸增多,表明N-去甲基克拉霉素通過增加Bax/Bcl-2的比例,降低了線粒體膜電位,激活以線粒體為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)細胞凋亡。N-去甲基克拉霉素能夠下調(diào)SIRT1蛋白,從而促進了p53和Bax上調(diào)。在N-去甲基克拉霉素誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡中,p38、ERK和JNK均被激活,并且三種MAPK的特異性抑制劑均對凋亡有促進作用,表明它們均發(fā)揮了促