普通針毛蕨DEDC誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、普通針毛蕨Macrothelypteris torresiana (Gaud.)Ching是金星蕨科針毛蕨屬植物,主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)。由于該植物具有親熱解毒，軟堅(jiān)散結(jié)的功效，在民間常被用于止血和治療水腫。已有文獻(xiàn)報(bào)道，普通針毛蕨中所含的主要成分Protoapigenone具有良好的抗腫瘤活性，且對(duì)諸多腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，由該植物首次提取制備的黃酮類化合物2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5

2、-烯)-5,7-二羥基-色原酮（DEDC）是Protoapigenone的結(jié)構(gòu)類似物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞也呈現(xiàn)出顯著的增殖抑制活性。
　　 近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)，植物黃酮(flavonoids)集許多優(yōu)良的生理、藥理學(xué)活性于一身，在癌癥及心血管疾病的預(yù)防、治療方面以其天然、高效、低毒的特點(diǎn)而倍受矚目。黃酮類化合物抗腫瘤機(jī)制的報(bào)道常常見(jiàn)諸報(bào)端，但是總的來(lái)說(shuō)，其具體的防癌、抗癌機(jī)理目前尚未明確。近一兩年國(guó)外研究者在植物黃酮抗腫瘤研究方面取得了

3、突破性的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)許多藥物具有的抗氧化與促氧化活性、生物膜保護(hù)作用、線粒體毒性損傷、蛋白酶體抑制反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制與調(diào)節(jié)功能在抗腫瘤效應(yīng)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面起關(guān)鍵作用。
　　 植物黃酮結(jié)構(gòu)上屬于多酚類植物化合物，一直被認(rèn)為是高效的天然抗氧化劑。事實(shí)上，植物黃酮作為功能物質(zhì)起效時(shí)，同時(shí)具有抗氧化與促氧化兩種截然相反的特性。人們通常把植物黃酮對(duì)疾病的預(yù)防作用歸因于其具有良好的抗氧化活性及自由基清除特性。事實(shí)上，這些多酚類化合物在抗

4、癌及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，其促氧化活性起著比抗氧化更為重要的作用。研究表明，這些植物多酚類物質(zhì)能催化谷胱甘肽(GSH)或輔酶I氧化而產(chǎn)生活性氧（ROS），而許多化療藥物能誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA片段化引起不可逆損傷并促使腫瘤細(xì)胞凋亡都是通過(guò)ROS介導(dǎo)產(chǎn)生的。
　　 目前，對(duì)于黃酮類化合物DEDC的抗腫瘤作用機(jī)制并不十分清楚，認(rèn)為至少可能包括以下兩個(gè)方面：1．DEDC通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)的促氧化作用，造成氧化壓力，引起氧化應(yīng)激而損傷生物膜、DNA

5、及其它生物大分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。2．通過(guò)在較高濃度下產(chǎn)生ROS調(diào)節(jié)某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如：絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)；轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子3（STAT3）；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）等的活性，繼而調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過(guò)程的各個(gè)方面，包括細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。
　　 本研究用DEDC處理人肝癌細(xì)胞HepG2以及人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y后，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法、MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)C

6、M）、凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）、免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western-blot）、和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等方法分別檢測(cè)HepG2及SH-SY5Y細(xì)胞在DEDC處理后，細(xì)胞DNA損傷情況和凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平的變化。為了進(jìn)一步闡明ROS及有關(guān)細(xì)胞信號(hào)分子在腫瘤細(xì)胞凋亡中所起的作用，ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)，JNK1/2抑制劑SP600125，P38 MAPK抑制劑SB203580被用于實(shí)驗(yàn)，測(cè)定ROS、JNK

7、、P38等信號(hào)分子在DEDC誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡中起什么作用；同時(shí)，NAC和NF-κB抑制劑PDTC被用于檢測(cè)ROS和NF-κB對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。
　　 第一部分 DEDC對(duì)HepG2細(xì)胞毒性作用及其凋亡機(jī)制的研究
　　 鑒于黃酮類化合物protoapigenone展示出較強(qiáng)的抗癌活性，本試驗(yàn)旨在探討其結(jié)構(gòu)類似物2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-5,7-二羥基-色原酮 (DEDC)，一種

8、首次從普通針毛蕨分離得到的黃酮類化合物，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)抑制作用及其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，同時(shí)為進(jìn)一步檢測(cè)了ROS捕獲劑NAC及MAPK通路抑制劑對(duì)DEDC誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中采取了對(duì)細(xì)胞預(yù)先用不同抑制劑加以處理的方法再觀察腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)的變化。
　　 將肝癌細(xì)胞HepG2和肝正常細(xì)胞LO2分別暴露于DEDC（2.5，5，10μg/ml）或protoapigenone（2.5，5，10μg/ml）24 h后，使用臺(tái)盼藍(lán)染色

9、法、流式細(xì)胞術(shù)、和Western blot技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞存活率、凋亡百分比、胞內(nèi)ROS積累、線粒體膜電位變化情況及Procaspase-3，-8，-9、Bcl-2家族成員、MAPK通路蛋白等凋亡相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：
　　 與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)DEDC高度敏感（＃P<0.1），而protoapigenone對(duì)上述兩種細(xì)胞株均有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。在DEDC處理的HepG2細(xì)胞中我們檢測(cè)到持續(xù)而快速產(chǎn)

10、生的活性氧自由基ROS并伴隨著細(xì)胞膜電位的降低，當(dāng)細(xì)胞用NAC預(yù)孵育后ROS水平的升高及細(xì)胞電勢(shì)的降低則均被取消。從免疫印記實(shí)驗(yàn)可知，在DEDC的處理引起了HepG2細(xì)胞中細(xì)胞色素C從線粒體向胞漿釋放，Procaspase-3，-8，-9的降解，Bcl-2/Bax比值減小，JNK、P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑的磷酸化激活。細(xì)胞分別經(jīng)各抑制劑預(yù)處理后，則發(fā)現(xiàn)NAC及JNK特異性抑制劑SP600125顯著地抑制了DEDC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而P

11、38特異性抑制劑SB203580則促進(jìn)了DEDC誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。
　　 綜上所述，DEDC在一定劑量水平上能顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖而對(duì)肝正常細(xì)胞LO2損傷微小，顯示出良好的生物活性。DEDC誘導(dǎo)的凋亡與胞內(nèi)ROS水平上升明顯相關(guān)，而且從免疫印記實(shí)驗(yàn)也證明ROS介導(dǎo)的Bcl-2和Caspase途徑依賴的線粒體功能紊亂是DEDC誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。同時(shí)，JNK和P38 MAPK信號(hào)通路也參與了對(duì)凋亡的調(diào)控，但

12、JNK的活化表現(xiàn)為正向調(diào)節(jié)作用而P38 MAPK信號(hào)通路則表現(xiàn)為負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　 第二部分 DEDC對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用及其凋亡機(jī)制的研究
　　 神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤之一。目前，該病的發(fā)生機(jī)制尚不明確，是臨床治療及實(shí)驗(yàn)室研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究擬探討黃酮類化合物DEDC對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y增殖活性的影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、核因子κB（NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在

13、凋亡過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用。
　　 將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、肺腺癌細(xì)胞A549、前列腺癌細(xì)胞PC-3、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7暴露于DEDC（2.5，5，7.5，10μg/ml）24 h后，通過(guò)MTT比色法，求出各細(xì)胞株的半數(shù)抑制率（IC50值）。凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)了將SH-SY5Y細(xì)胞暴露于DEDC (7.5μg/ml)不同時(shí)間（3 h，6 h，12 h，24 h）后，核內(nèi)NF-κB蛋白結(jié)合活性的變化情況。We

14、stern blot檢測(cè)了SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度的DEDC（2.5，5，7.5，10μg/ml）后，STAT3、NF-κB、p53、p21、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。為進(jìn)一步闡明ROS及NF-κB信號(hào)分子在SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用，我們使用熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot技術(shù)對(duì)比了存在和不存在ROS捕獲劑NAC或NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲

15、酸鹽（PDTC）時(shí)，細(xì)胞凋亡百分比、細(xì)胞周期分布、胞內(nèi)ROS積累、及NF-κB、P53、Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示：四種腫瘤細(xì)胞的IC50值范圍從5.2μg/ml到11.5μg/ml，其中SH-SY5Y細(xì)胞的IC50值最低，說(shuō)明該種細(xì)胞對(duì)DEDC最敏感，因此被選擇作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。與對(duì)照組比較，DEDC誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡率、G2/M期阻滯的細(xì)胞比例、胞內(nèi)ROS水平的上升均有顯著性差異。DEDC能

16、有效抑制轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子3（STAT3）通路的異常激活是該化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。通過(guò)檢測(cè)抑制劑對(duì)凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)DEDC誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡是胞內(nèi)ROS積累繼而引發(fā)一連串凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，抗氧化劑NAC能顯著抑制ROS的產(chǎn)生并阻斷DEDC誘導(dǎo)凋亡活性；核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過(guò)程中被活化，而抑制NF-κB通路能顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DEDC促凋亡效應(yīng)的敏感性，DEDC與PDTC聯(lián)用對(duì)

17、引發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯的協(xié)同效應(yīng)。
　　 綜上所述，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y對(duì)DEDC高度敏感，凋亡作用的產(chǎn)生與DEDC能增加腫瘤細(xì)胞ROS的積累密切相關(guān)。在凋亡過(guò)程中，DEDC通過(guò)ROS介導(dǎo)的對(duì)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)是該化合物誘導(dǎo)凋亡的重要作用機(jī)制；凋亡調(diào)節(jié)蛋白P53、P21、CyclingB1、Bcl-2、Bax均參與了對(duì) SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的調(diào)控；NF-κB通路被激活在DEDC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋