siRNA對α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的下調(diào)作用及其增敏紫杉醇對乳腺癌細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　 1、研究siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-435表面α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GalⅠ)水平的下調(diào)作用。
　　 2、研究乳腺癌細胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下調(diào)后,增敏紫杉醇對該細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　 3、研究乳腺癌細胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下調(diào)后,聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇對該細胞與細胞外基質(zhì)黏附作用的影響。
　　 方法：
　　 1、siRNA對

2、α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GalⅠ)水平的下調(diào)作用。
　　 1)、構(gòu)建低α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶乳腺癌細胞模型(即AS細胞):以ST6GalⅠ的siRNA沉默乳腺癌細胞MDA-MB-435 ST6 GalⅠ mRNA的表達,構(gòu)建穩(wěn)定的低a-2,6.唾液酸轉(zhuǎn)移酶乳腺癌細胞模型；同時構(gòu)建乳腺癌細胞空載體模型(即MOCK細胞)作為對照；
　　 2)、以RT-PCR檢測MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞中

3、ST6GalⅠ mRNA的表達水平；
　　 3)、以FITC-MAA、FITC-SNA、FITC-PNA標(biāo)記MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞,用流式細胞儀檢測各組細胞表面α-2,3-唾液酸、α-2,6-唾液酸和細胞表面總唾液酸的表達水平。
　　 2、乳腺癌細胞表面ST6GalⅠ水平下調(diào)后,對紫杉醇誘導(dǎo)該細胞凋亡的增敏效應(yīng)。
　　 1)、紫杉醇對不同唾液酸化的乳腺癌細胞(MDA-MB-435母代

4、細胞、AS細胞、MOCK細胞)的凋亡敏感性比較:以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三個濃度紫杉醇分別處理MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞,酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度,進而篩選出紫杉醇誘導(dǎo)三組細胞凋亡的最佳濃度；
　　 2)、以篩選出的紫杉醇濃度處理三組乳腺癌細胞(MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞),臺盼藍染色顯微鏡下觀察細胞形態(tài),并計算紫杉醇作用下各組細胞的存活率；

5、
　　 3)、以篩選出的紫杉醇濃度處理三組乳腺癌細胞(MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞),AnexinV-PI雙染凋亡試劑盒標(biāo)記,用流式細胞儀檢測紫杉醇對其的誘導(dǎo)凋亡情況；
　　 4)、以篩選出的紫杉醇濃度處理三組乳腺癌細胞(MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞),用caspase-3試劑盒檢測各組細胞中caspase-3酶活性,進而了解紫杉醇對其的誘導(dǎo)凋亡情況；
　　 5)、

6、以篩選出的紫杉醇濃度處理三組乳腺癌細胞(MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞),用caspase-8試劑盒檢測各組細胞中caspase-8酶活性,進而了解紫杉醇對其的誘導(dǎo)凋亡情況。
　　 3、乳腺癌細胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下調(diào)后,聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇對該細胞與細胞外基質(zhì)黏附作用的影響。
　　 1)、MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞與不同濃度的細胞外基質(zhì)(FN/Colla

7、genⅣ)黏附實驗,用CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測黏附細胞數(shù)量差異,選擇出用該兩種細胞外基質(zhì)進行黏附實驗所需的最佳ECM含量；
　　 2)、用最佳的FN/CollagenⅣ量鋪板,進行MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞與細胞外基質(zhì)(FN/CollagenⅣ)黏附實驗,比較三組細胞間的黏附性差異,用CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測黏附細胞數(shù)量差異；
　　 3)、聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇后,用最佳的FN/Coll

8、agenⅣ量鋪板,進行三組細胞與細胞外基質(zhì)(FN/CollagenⅣ)黏附實驗,用CCK-8細胞活性檢測試劑盒檢測黏附細胞數(shù)量差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、RT-PCR檢測MDA-MB-435母代細胞、AS細胞、MOCK細胞中ST6GalⅠmRNA的表達水平:母代細胞表達量最高,其次是MOCK細胞,AS細胞中ST6GalⅠ mRNA的表達水平最低。說明siRNA對α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GalⅠ)水平具有下調(diào)作

9、用。
　　 2、流式細胞儀檢測各組細胞表面唾液酸的表達水平:三組細胞中,以FITC-PNA和MAA抗體標(biāo)記的表達水平無明顯差異,但以FITC-SNA抗體標(biāo)記的在AS細胞中表達水平明顯下降。
　　 3、以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三個濃度紫杉醇分別處理三組細胞,篩選出紫杉醇誘導(dǎo)三組細胞凋亡的最佳濃度為:10-7mol/L。
　　 4、以10-7mol/L的紫杉醇處理三組乳腺癌細胞,用

10、臺盼藍染色顯微鏡下細胞存活率計數(shù)結(jié)果顯示:MDA-MB-435母代細胞形態(tài)尚可,包膜完整,胞質(zhì)清亮,存活率約為82％；MOCK細胞胞體變大,變圓,部分細胞發(fā)生融合,存活率約為67％:AS細胞出現(xiàn)大量融合,細胞呈圓形,胞膜不規(guī)則,不完整,存活率僅為48％。
　　 5、以10-7mol/L的紫杉醇處理三組乳腺癌細胞,流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:母代細胞凋亡百分率為9.1％,MOCK細胞凋亡百分率為17.3％,AS細胞凋亡百分率為30.2

11、％。
　　 6、以10-7mol/L的紫杉醇處理三組乳腺癌細胞,caspase-3試劑盒檢測結(jié)果顯示:AS細胞中easpase-3酶活性最大,紫杉醇對其誘導(dǎo)凋亡作用最強；MOCK細胞和母代細胞中caspase-3酶活性明顯低于AS細胞,兩者之間差別不大。
　　 7、以10-7mol/L,的紫杉醇處理三組乳腺癌細胞,caspase-8試劑盒檢測結(jié)果顯示:AS細胞中caspase-8酶活性最大,紫杉醇對其誘導(dǎo)凋亡作用最強；M

12、OCK細胞和母代細胞明顯低于AS細胞。
　　 8、三組細胞與不同濃度的細胞外基質(zhì)(FN/CollagenⅣ)黏附實驗結(jié)果顯示:隨著ECM含量的增加,發(fā)生黏附的細胞數(shù)量也增加,兩者近似呈線性關(guān)系。母代細胞與細胞外基質(zhì)的黏附性最強,MOCK細胞情況與其相仿,而AS細胞的黏附性最弱,同時,與FN黏附的細胞數(shù)量要高于與CollagenⅣ黏附組。選擇出用該兩種細胞外基質(zhì)進行黏附實驗所需的最佳ECM含量,即5μg/孔。
　　 9、用

13、5pg/孔FN/CollagenⅣ鋪板,三組細胞與它們黏附實驗結(jié)果顯示:母代細胞與細胞外基質(zhì)的黏附性最強,MOCK細胞情況與其相仿,而AS細胞的黏附性最弱。其中鋪FN組的黏附性要強于鋪CollagenⅣ組。
　　 10、聯(lián)合應(yīng)用紫杉醇后,用5μg/孔FN/CollagenⅣ鋪板,三組細胞與細胞外基質(zhì)的黏附性顯示:均較未用紫杉醇時黏附性降低,其中母代最強,MOCK細胞略低于母代細胞,而AS細胞的黏附性最弱。同樣,鋪FN組細胞的黏附