腫瘤激光免疫療法的免疫調(diào)控機(jī)制及應(yīng)用研究.pdf

1、惡性腫瘤是以細(xì)胞異常增生為特征的常見疾病，早期診斷和及時(shí)治療是降低腫瘤患者死亡率的關(guān)鍵。但惡性腫瘤的早期診斷和有效控制仍是醫(yī)學(xué)界的棘手問題。手術(shù)治療、放射治療與藥物治療仍是目前治療惡性腫瘤的常規(guī)手段。但這些傳統(tǒng)的治療手段常難以獲得理想效果，醫(yī)學(xué)界仍在不斷探索治療腫瘤的新方法。光動(dòng)力學(xué)療法（Photodynamic therapy，PDT）是逐漸趨向成熟的治療腫瘤和非腫瘤疾病的一種新手段。光動(dòng)力學(xué)療法因具有目標(biāo)專一、效果顯著、對(duì)正常組織傷

2、害小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中取得了令人矚目的成就。
　　 激光免疫療法（Laser immunotherapy，LIT）是在光動(dòng)力學(xué)療法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種將特定波長的激光、光敏劑（光吸收劑）和免疫佐劑相結(jié)合的腫瘤綜合治療新方法。激光免疫療法既利用了激光光熱、光化學(xué)的局部破壞作用，又激發(fā)了宿主的免疫防御系統(tǒng)。作為一種新型腫瘤治療方法，遠(yuǎn)期療效好，在惡性腫瘤治療上展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。但其抗腫瘤免疫機(jī)制尚未明確，免疫效率也有待提高?；?/p>

3、揭示機(jī)理提高療效的目的，本課題運(yùn)用現(xiàn)代熒光成像技術(shù)，從細(xì)胞和在體兩方面去揭示激光免疫療法引起的細(xì)胞殺傷及機(jī)體免疫機(jī)制，并探討其內(nèi)在聯(lián)系。并在機(jī)理研究的基礎(chǔ)上探討、發(fā)展更為有效的腫瘤治療方法。激光免疫療法的抗腫瘤免疫機(jī)制的研究，將有利于填補(bǔ)激光免疫療法的基礎(chǔ)理論，并進(jìn)一步推動(dòng)激光免疫療法的開發(fā)及應(yīng)用。
　　 本研究以檢測(cè)活細(xì)胞和在體內(nèi)激光免疫療法引起的細(xì)胞死亡及機(jī)體免疫過程為中心，運(yùn)用現(xiàn)代熒光成像等技術(shù)，從細(xì)胞和在體水平揭示激光免

4、疫療法引起的細(xì)胞凋亡以及機(jī)體免疫調(diào)控機(jī)制。分別從光動(dòng)力療法對(duì)腫瘤的殺傷機(jī)制和免疫效應(yīng)機(jī)制著手，探討激光免疫療法中最為重要的兩個(gè)因素-殺傷效應(yīng)和免疫效應(yīng)的作用機(jī)制，深入探討二者之間的聯(lián)系，尋找最佳的殺傷效應(yīng)與免疫效應(yīng)的結(jié)合。
　　 同時(shí)，本研究基于殺傷機(jī)制與免疫調(diào)控機(jī)制的研究，逐步發(fā)展探索新的治療方法，尋求能將殺傷效應(yīng)和免疫效應(yīng)有效結(jié)合、顯著提高腫瘤治療效果、減少機(jī)體損傷的腫瘤治療方法，推動(dòng)激光免疫療法在腫瘤治療中的應(yīng)用。主要結(jié)果

5、如下：
　　 1，深入探討光動(dòng)力治療過程中殺傷效應(yīng)和免疫機(jī)制之間的聯(lián)系。本研究應(yīng)用熒光成像等技術(shù)，實(shí)時(shí)檢測(cè)PDT誘導(dǎo)的凋亡/壞死細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用過程。結(jié)果顯示：PDT誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞能夠被巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，并能夠活化巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡早期，胞質(zhì)內(nèi)的部分熱休克蛋白70（Heat shock protein，HSP70）迅速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面，并在整個(gè)凋亡過程中穩(wěn)定存在于細(xì)胞表面。通過多克隆抗體阻斷凋亡細(xì)胞表面HSP

6、70的作用，則顯著降低巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬及巨噬細(xì)胞的活化。阻斷巨噬細(xì)胞表面HSP70受體同樣有效抑制凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。以上研究結(jié)果證明，PDT誘導(dǎo)的凋亡和壞死細(xì)胞均能活化巨噬細(xì)胞，且HSP70以不同方式參與活化調(diào)控。在壞死細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化過程中，攜帶抗原的HSP70釋放出壞死細(xì)胞，被巨噬細(xì)胞識(shí)別，吞噬，引起巨噬細(xì)胞的活化。在凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化過程中，凋亡細(xì)胞內(nèi)部分HSP70轉(zhuǎn)位細(xì)胞表面，被巨噬細(xì)胞表面的HS

7、P70受體識(shí)別，進(jìn)而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬，獲得抗原；并通過激活受體介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)而活化巨噬細(xì)胞。本研究首次發(fā)現(xiàn)PDT誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞能夠刺激巨噬細(xì)胞活化，并首次探討凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞不同的免疫刺激調(diào)控過程，有助于深入了解PDT誘導(dǎo)的免疫調(diào)控機(jī)制，為PDT臨床應(yīng)用及激光免疫療法的發(fā)展提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 2，開發(fā)單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWNTs）介導(dǎo)的線粒體靶向殺傷

8、的腫瘤激光熱療法。為了避免PDT治療過程中光敏劑的光毒性，并充分利用HSP70的免疫調(diào)節(jié)作用，我們尋找一種優(yōu)化的激光治療方法--碳納米管介導(dǎo)的光熱療法。碳納米管是一種新穎的納米材料，在近紅外區(qū)域?qū)す饽芰烤哂袕?qiáng)烈吸收效應(yīng)，并將光能量迅速轉(zhuǎn)化為熱能，產(chǎn)生的熱效應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞的立刻崩潰。本研究中采用的CoMoCAT SWNTs具有結(jié)構(gòu)均一（直徑0.81 nm）、在近紅外980 nm處有特征吸收峰等特點(diǎn)。結(jié)果顯示：SWNTs與細(xì)胞共孵育能夠進(jìn)入

9、細(xì)胞，在激光照射下，能迅速將光能轉(zhuǎn)化為熱能，有效殺傷細(xì)胞。進(jìn)一步研究SWNTs在細(xì)胞內(nèi)的定位發(fā)現(xiàn)，SWNTs能夠選擇性定位于線粒體，而不進(jìn)入溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器。深入探討SWNTs定位機(jī)理發(fā)現(xiàn)，阻斷細(xì)胞膜的吞噬能力并不影響SWNTs進(jìn)入細(xì)胞，但破壞線粒體的膜電位則會(huì)影響SWNTs在線粒體的定位，因此SWNTs能夠選擇性定位于線粒體與線粒體膜電位相關(guān)。在激光照射下，定位于線粒體的SWNTs能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為熱能，通過破壞線粒體誘

10、導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步在體研究顯示，Laser+SWNTs治療組的腫瘤生長抑制效果、小鼠瘤體脫落數(shù)及小鼠存活數(shù)均明顯高于Laser治療組，碳納米管的應(yīng)用顯著增強(qiáng)了激光熱療的效果。本研究首次發(fā)現(xiàn)SWNTs能夠作為一種靶向線粒體的光熱轉(zhuǎn)換探針，并首次將其應(yīng)用于腫瘤光熱治療。
　　 3，開發(fā)新的激光免疫療法將殺傷效應(yīng)與免疫效應(yīng)有效結(jié)合。我們將免疫佐劑修飾的碳納米管應(yīng)用于光熱治療，建立一種新的光熱免疫療法。利用SWNTs的光熱轉(zhuǎn)換特性及藥物

11、運(yùn)載特性，能有效的將免疫佐劑運(yùn)送至腫瘤部位，并在激光照射下殺傷腫瘤細(xì)胞。利用免疫佐劑的大分子特征，既能結(jié)合SWNTs增強(qiáng)其生物活性，又能保持免疫佐劑特性。本研究采用SWNT-GC復(fù)合物為光吸收材料和免疫增強(qiáng)劑，以波長980 nm激光作為光源，治療小鼠乳腺癌等模型。結(jié)果顯示：SWNT-GC能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在激光照射下，SWNT-GC通過協(xié)同作用將熱殺傷效應(yīng)和免疫增強(qiáng)效應(yīng)有機(jī)結(jié)合起來。SWNT吸收光能產(chǎn)生熱能殺傷細(xì)胞，定位在腫瘤部位內(nèi)的G

12、C結(jié)合凋亡過程中產(chǎn)生的內(nèi)源抗原（HSP70），聯(lián)合增強(qiáng)免疫應(yīng)答。Laser+SWNT-GC治療組不僅能夠有效殺傷腫瘤，而且能夠引發(fā)長期的抗腫瘤免疫效應(yīng)，控制腫瘤復(fù)發(fā)。本研究采用免疫修飾的碳納米管開拓了一種新的激光免疫治療方法，不僅避免了傳統(tǒng)應(yīng)用光敏劑所引起的機(jī)體光敏毒性，而且應(yīng)用近紅外980 nm激光有效增加治療深度，利用特異性光熱轉(zhuǎn)換吸收劑增強(qiáng)殺傷效應(yīng)。并且首次提出光吸收劑和免疫佐劑同體系應(yīng)用、協(xié)同作用的方法，增強(qiáng)殺傷和免疫刺激作用。