錘頭狀核酶、反義RNA對大鼠肺動(dòng)脈平滑肌NHE-1活性及細(xì)胞增殖的作用.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)通過將Na<'+>/H<'+>交換器-1 (NHE-1)特異性錘頭狀核酶和反義RNA體外轉(zhuǎn)染肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,并檢測細(xì)胞中NHE-1表達(dá)、Na<'+>/H<'+>交換活性、 pHi的變化,及其與細(xì)胞增殖變化的關(guān)系,探討NHE-1在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.研究內(nèi)容包括:1.根據(jù)大鼠NHE-1mKNA序列,設(shè)計(jì)井合成兩條錘頭狀核酶,應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增獲得反義RNA序列;并將其分別克隆于反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN的多克隆位點(diǎn)中.2.

2、采用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑將重組載體轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞.RT-PCR方法檢測NHE-1mRNA表達(dá).3. 檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞pHi變化,<'22>Na攝取量的改變.檢測誘導(dǎo)細(xì)胞酸化后pHi恢復(fù)速率,不同細(xì)胞外Na<'+>濃度下pHi恢復(fù)速率等Na<'+>/H<'+>交換活性指標(biāo)變化.檢測<'3>H-TdR摻入量等細(xì)胞增殖指標(biāo)的變化.4.檢測細(xì)胞在10﹪血清、PDGF和EGF作用后, pHi和<'22>Na攝取量變化;Na<'+>/H