臍帶血多能成體祖細(xì)胞體內(nèi)外血管內(nèi)皮分化潛能的研究.pdf

1、人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)或多能成體干/祖細(xì)胞(multipotential adult stem/progenitor cells，MASCs/MAPCs)具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增及多向分化潛能，是干細(xì)胞治療研究領(lǐng)域的前沿。目前，研究發(fā)現(xiàn)MSCs/MrAPCs在體內(nèi)外能夠向內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而用于各種缺血性疾病的治療。本研究按照已經(jīng)建立的方法，從臍帶血(umbilical cord blood，U

2、CB)中分離純化MAPCs(UCB-MAPCs)，并進(jìn)一步觀察體外向血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化情況，從而探討為組織工程血管構(gòu)建提供種子細(xì)胞的可能性。 本文收集健康產(chǎn)婦足月臍血，以密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)進(jìn)行體外貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增UCB-MAPCs，用含10ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)、2ng/ml胰島素樣

3、生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)、2％胎牛血清(fetal boyine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基對(duì)第3代UCB-MAPCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀技術(shù)及共聚焦成像技術(shù)了解分化后細(xì)胞的特性。結(jié)果顯示，分化9天后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞保持貼壁狀態(tài)，形態(tài)變化較小，胞體略縮短變寬，部分呈多角形、鵝卵石樣；免疫組化顯示誘導(dǎo)9天后的細(xì)胞表達(dá)VWF及VE-cadllesion(

4、CD144)；流式結(jié)果顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞繼續(xù)高表達(dá)CD29、CD44、CD?3、CD90、CD95、CD105等表面抗原，部分開(kāi)始表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記KDR、CD62E，vWF與CD144的表達(dá)量較前增高，但不表達(dá)CD14、CD45；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示部分細(xì)胞具有吸收ac-LDL及結(jié)合UEA-1的能力；分化14天后激光共聚焦顯示全部細(xì)胞均具有吸收ac-LDL及結(jié)合UEA-1的能力。此外，誘導(dǎo)9天后細(xì)胞的增殖能力較分化前下降，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，

5、處于G0/G1期的細(xì)胞相對(duì)減少，但仍占75.51％。因此，在特定的誘導(dǎo)分化條件下，UCB-MAPCs在體外具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。 在缺血性疾病中，機(jī)體的代償性反應(yīng)包括細(xì)小動(dòng)脈形成和血管新生。本文進(jìn)一步探討臍帶血來(lái)源MAPCs在體內(nèi)向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，以及移植體外誘導(dǎo)分化前后的臍帶血MAPCs對(duì)小鼠缺血后肢恢復(fù)的影響。我們建立了單側(cè)后肢缺血的BALB/c小鼠模型，局部肌肉移植臍帶血MAPCs或經(jīng)內(nèi)皮分化9天的MAPCs(

6、MAPC-EPCs)(均為5×10<'5>/只)，對(duì)照組局部肌肉注射DF12培養(yǎng)基。利用熒光示蹤移植細(xì)胞的去向，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)移植前后患肢的血流灌注和毛細(xì)血管密度。結(jié)果顯示：移植后MAPCs或MAPC-EPCs均能夠整合到缺血局部的毛細(xì)血管。臍血MAPCs在體內(nèi)也有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，體內(nèi)移植擴(kuò)增的MAPCs能改善缺血后肢的血流灌注，促進(jìn)肢體缺血的恢復(fù)，且效果優(yōu)于體外誘導(dǎo)分化后的臍血源EPCs。 目前，成體干細(xì)胞的研究多數(shù)集中于

7、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。本研究進(jìn)一步探討臍帶Wharton’s Jelly組織中是否存在類似的MAPCs，并檢測(cè)其生物學(xué)特征。通過(guò)植塊培養(yǎng)法或酶消化法，應(yīng)用低血清培養(yǎng)基均可獲得梭形貼壁細(xì)胞。其中以去除臍靜脈內(nèi)膜后植塊貼壁培養(yǎng)獲得的貼壁細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性穩(wěn)定。植塊貼壁后5～14天(中位8天)可見(jiàn)貼壁細(xì)胞爬出。多數(shù)為規(guī)則的梭形或紡錘形，偶見(jiàn)卵石狀或多角形的類內(nèi)皮樣細(xì)胞以及扁平寬大的類表皮樣細(xì)胞。14天時(shí)計(jì)數(shù)有貼壁細(xì)胞爬出的貼塊

8、達(dá)18.75％～81.75％(中位52.08％)，15～17天去貼塊，17～23天(中位18天)達(dá)80％～100％融合，消化后可獲(0.27～7.7)×10<'5>/T25，細(xì)胞可穩(wěn)定傳代。該類細(xì)胞的增殖活性與骨髓MSCs相似，但較臍血MAPCs差。此外，該類細(xì)胞的表型特征也與骨髓MSCs類似，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，CD14，CD3、HLA-DR和CDl33以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記KDR、CD31、和vWF，整合素和粘附分子CD

9、44、CD90、CD95以及CD73、CD105高表達(dá)；而臍帶血MAPCs除具備上述特征外還低表達(dá)vWF及CD144。因此，臍帶Wharton’s Jelly組織中存在一類與骨髓MSCs以及臍帶血MAPCs生物學(xué)特征相類似的細(xì)胞，為MSCs/MAPCs的研究提供了更廣泛的細(xì)胞來(lái)源。 在缺血性疾病中，機(jī)體的代償性反應(yīng)包括細(xì)小動(dòng)脈形成和血管新生，而內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在其中

10、發(fā)揮著重要的作用，參與了機(jī)體多種生理、病理性血管重建過(guò)程。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，在骨髓、外周血、臍血和胎肝中均存在EPCs。本研究進(jìn)行了外周血、臍帶血、骨髓以及臍帶來(lái)源EPCs的分離培養(yǎng)方法及其生物學(xué)特性的比較。通過(guò)密度梯度離心法分離外周血、臍帶血以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，應(yīng)用含不同生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，臍帶來(lái)源的EPCs通過(guò)植塊貼壁培養(yǎng)或膠原酶消化臍靜脈內(nèi)膜獲得的MNCs進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。對(duì)獲得的貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖活力、細(xì)胞周

11、期、免疫表型的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血與臍帶血來(lái)源的貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，集落狀生長(zhǎng)，其上附有成簇圓形細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，圓形細(xì)胞漸脫落，梭形細(xì)胞沒(méi)有明顯增殖趨勢(shì)，消化后細(xì)胞不能傳代；流式顯示細(xì)胞高表達(dá)CD45，部分表達(dá)KDR，但不表達(dá)CD31；而且以含2％FCS、10ng/ml VEGF、10ng/ml FGF、10ng/ml EGF、2ng/mlIGF、40％MCDB201、1×ITS、10<'-4>M抗壞血酸2-磷酸、100u/ml

12、青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F<,12>培養(yǎng)基所獲集落數(shù)、貼壁細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞得率較高。骨髓和臍帶來(lái)源的貼壁細(xì)胞呈短梭形、多角形；傳代后細(xì)胞增殖迅速，且細(xì)胞形態(tài)與增殖活力沒(méi)有明顯下降；多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期；流式檢測(cè)顯示細(xì)胞均不表達(dá)CD14、CD45，也不表達(dá)CD1a、CD106、HLA-DR，但高表達(dá)CD44、CD90、CD62E、CD73、CD95、CD105；部分表達(dá)內(nèi)皮系標(biāo)記KDR。免疫組化顯示四種來(lái)源的細(xì)胞均表達(dá)