血管內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)、分化、鑒定及其促募集、分化的蛋白研究.pdf

1、研究目的： 利用免疫磁珠分離法獲取人臍血血管內(nèi)皮祖細胞，進行培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化、鑒定的研究；利用腫瘤組織建立血管內(nèi)皮祖細胞體外促募集、分化模型，雙向蛋白電泳分析其促血管內(nèi)皮祖細胞募集、分化的蛋白成分。 研究內(nèi)容和方法: 第一部分人臍血來源血管內(nèi)皮祖細胞體外培養(yǎng)、分化和鑒定特性研究在剖腹產(chǎn)過程中采集胎盤端的臍帶血，采用密度梯度離心法獲取臍帶血中的單個核細胞；分別利用CD34和CD133免疫磁珠試劑盒進行分選，獲取CD3

2、49<'+>、CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細胞，行臺盼藍染色鑒定細胞活性，流式細胞儀檢測臍血中CD34<'+>、CD133<'+>細胞含量和所獲取的CD34<'+>、CD133<'+>細胞純度；分別用EBM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)CD34<'+>、CD133<'+>細胞，觀察血管內(nèi)皮祖細胞生長、分化情況，培養(yǎng)7天后，進行DIL-LDL和FITC-LECTIN攝取實驗、CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定，將剛分離獲取的、培養(yǎng)4天、培養(yǎng)7天的CD34<'+

3、>和CD133<'+>細胞和HLNECs分別行體外血管生成實驗，比較CD34<'+>和CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細胞的生長特性；分別用EBM-2培養(yǎng)液培養(yǎng)CD34<'->和CD133<'->細胞，觀察免疫磁珠分選后剩余細胞生長、分化情況，培養(yǎng)7天后行CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定；分別將CD34<'+>細胞和單核細胞凍存于液氮中，分別于凍存3、6、12、18個月時復(fù)蘇細胞，行臺盼藍染色鑒定細胞活性，分別進行培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后行CD34和Ⅷ

4、因子免疫組化鑒定及形成內(nèi)皮細胞集落計數(shù)，比較不同凍存時間對血管內(nèi)皮祖細胞活性及增殖能力的影響。 第二部分人臍血來源血管內(nèi)皮祖細胞體外促募集、分化模型建立使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌BEL-7402細胞，將BEL-7402細胞消化后，重懸于PBS液中，按10<'7>個細胞/只的量注射于10～14g的雌性裸鼠頸后皮下部位；觀察裸鼠注射位置的腫瘤生長情況；當腫瘤組織生長達直徑1cm，即行手術(shù)切除腫瘤組織；實驗組中，將部分腫瘤組織行石蠟

5、切片及HE染色檢查；將腫瘤組織切成2mm小塊，置于Transwell上室培養(yǎng)，下室接種免疫磁珠分選獲取的CD133<'+>細胞，進行共培養(yǎng)，對照組中則不加入腫瘤組織進行培養(yǎng)，期間分別收集兩組培養(yǎng)液，凍存待用；兩組使用同一培養(yǎng)液培養(yǎng)至7天，分別行DIL-LDL和FITC-LECTIN攝取實驗、CD34和Ⅷ因子免疫組化鑒定。 第三部分促血管內(nèi)皮祖細胞募集、分化的蛋白研究將上一步分所獲取的兩組培養(yǎng)液，分別進行蛋白質(zhì)超濾濃縮、去除高豐度

6、蛋白及蛋白純化；再經(jīng)蛋白定量后，進行CyDye熒光標記，蛋白加樣進行常規(guī)2-DE和2D-DIGE分離。2-DE凝膠深紫熒光染色來檢測蛋白質(zhì)斑點，使用ImageMaster軟件進行表達圖譜分析；2D-DIGE凝膠中預(yù)先被Cydye染料標記的蛋白質(zhì)斑點，經(jīng)多功能激光掃描儀不同波長的激光掃描后，獲取熒光膠內(nèi)差異表達圖譜，使用DeCyder軟件分析。 研究結(jié)果: 1.CD34<'+>和CD34<'+>細胞數(shù)量、純度及細胞活性經(jīng)密

7、度梯度離心法獲取的單核細胞中，經(jīng)流式細胞儀檢測CD34<'+>細胞和CD133<'+>細胞含量為(1.18±0.84)﹪、(1.15±0.086)﹪，經(jīng)免疫磁珠分選獲取的兩者數(shù)量為(7.27±0.69)× 10<'6>、(9.26±0.47)× 10。，經(jīng)流式細胞儀鑒定兩者純度為(79.43±2.62)﹪、(91.45±1.04)﹪，經(jīng)臺盼藍染色鑒定兩者活細胞百分比為(94.85±2.36)﹪、(91.4±2.01)﹪。 2.C

8、D133<'+>、CD34<'+>細胞體外培養(yǎng)特性培養(yǎng)24h內(nèi)細胞全部貼壁生長。細胞逐漸形成梭形。在培養(yǎng)5～7d，團狀生長的梭形血管內(nèi)皮細胞形成局部典型的集落。 行Dil-LDL及FITC-Lectin攝取實驗，結(jié)果經(jīng)顯微鏡觀察絕大部分細胞均可見為雙染陽性。CD34<'+>細胞雙染陽性率與CD133<'+>細胞兩組行t檢驗，無顯著差異。行細胞免疫組化檢測CD34及Ⅷ因子表達情況，結(jié)果大多數(shù)細胞均陽性表達CD34及Ⅷ因子。CD34

9、<'+>細胞和CD133<'+>細胞及HLJVECs組間每100個細胞平均陽性率比較均無顯著差異。 體外血管生成實驗結(jié)果：①剛分離的CD34<'+>和CD133<'+>細胞無明顯管狀結(jié)構(gòu)形成；②培養(yǎng)4天后的CD34<'+>和CD133<'+>細胞可形成少數(shù)管狀結(jié)構(gòu)，兩者無顯著差異；③培養(yǎng)7天的CD34<'+>和CD133<'+>細胞形成較多管狀結(jié)構(gòu)，兩組無顯著差異；④HUVECs接種后形成管狀結(jié)構(gòu)，分別與培養(yǎng)1w的CD34<'+

10、>細胞和CD133<'+>細胞進行比較，結(jié)果無顯著差異。 3.CD133<'->細胞及CD34<'->細胞體外培養(yǎng)特性部分細胞逐漸胞體伸展、變大，逐漸形成梭形。細胞形態(tài)呈多樣化，有圓形、梭形等細胞貼壁生長。在培養(yǎng)5～7d，可見團狀生長的梭形血管內(nèi)皮細胞形成局部典型的集落。分別行細胞免疫組化檢測CD34及Ⅷ因子表達情況。結(jié)果僅少數(shù)細胞陽性表達CD34及Ⅷ因子。 4.凍存對于EPCs影響的比較凍存3、6、12、18個月的單核

11、細胞和CD34<'+>細胞復(fù)蘇后，經(jīng)臺盼藍染色，結(jié)果示不同凍存時間對于兩種細胞的活細胞比例沒有明顯的影響；不同凍存時間的單核細胞和CD34<'+>細胞復(fù)蘇后，經(jīng)體外培養(yǎng)，結(jié)果示不同凍存時間對于兩種細胞的集落形成數(shù)量有影響；兩種細胞形成的梭形細胞經(jīng)免疫組化證實為陽性表達CD34和Ⅷ因子。 5.裸鼠腫瘤組織模型建立Bel-7402細胞注射至裸鼠皮下，3～6天后可于裸鼠皮下有結(jié)節(jié)生成，隨著觀察時間推移，皮下結(jié)節(jié)也隨著增大。經(jīng)石蠟切片和

12、HE染色后顯微鏡下觀察，所獲取的腫瘤組織的細胞學(xué)形態(tài)與惡性腫瘤相近似。 6.腫瘤促血管內(nèi)皮祖細胞分化實驗組可見EPCs形成梭形，并有梭形細胞集落形成，行Dil-LDL及FITC-Lectin攝取實驗：Dil-LDL、FITC-Lectin攝取實驗示大部分細胞均可見為雙染陽性，免疫組化實驗示大部分細胞呈陽性；對照組的EPCs貼壁生長后，大部分細胞沒有明顯形態(tài)變化，僅有少量細胞胞體伸展、變長，沒有細胞集落形成。 Dil-LD

13、L及FITC-Lectin攝取實驗及免疫組化實驗僅少部分細胞陽性；兩組間差異顯著。 7.雙向蛋白電泳分析促EPCs募集、分化蛋白2D-DIGE分析結(jié)果進行MALDI-TOF-MS鑒定，成功鑒定出71種差異蛋白質(zhì)，從中篩選出屬于實驗組組上調(diào)的蛋白質(zhì)7類：表皮生長因子受體相關(guān)蛋白、PDZand LIM domain protein 5、ETS-1蛋白、熱休克蛋白60、順烏頭酸酶、G蛋白偶聯(lián)受體6。 結(jié)論: 1.CD3

14、4和CD133標記的免疫磁珠分選法是高效獲取EPCs的有效途徑； 2.CD34<'+>和CD133<'+>血管內(nèi)皮祖細胞體外培養(yǎng)特性相近； 3.體外凍存時間影響血管內(nèi)皮祖細胞的分化能力； 4.利用Transwell系統(tǒng)可成功建立腫瘤組織促血管內(nèi)皮祖細胞募集、分化模型； 5.2D-DIGE是靈敏度和可信度非常高的蛋白質(zhì)組學(xué)分離、檢測技術(shù)，是尋找和鑒定促EPCs募集、分化作用蛋白質(zhì)的有效方法； 6.表