內(nèi)生真菌稻鐮狀瓶霉基因敲除體系的構(gòu)建及六個(gè)細(xì)胞自噬基因的功能分析.pdf

1、自然界中，植物與微生物通常形成互利共生的體系，這對(duì)植物的生長(zhǎng)和自然生態(tài)系統(tǒng)都起著非常重要的作用。內(nèi)生真菌是一類能廣泛與植物互作并與植物保持平衡狀態(tài)的一類微生物，其生活史中至少有一部分能侵入并且定殖在健康植物組織中，且不引起宿主植物發(fā)病。暗色有隔內(nèi)生真菌是內(nèi)生真菌中的一大類群，嚴(yán)格定殖在植物的根部，能夠增強(qiáng)植物的抗逆性和抗病能力，同時(shí)能影響植物的群落。稻鐮狀瓶霉Harpophora oryzae是從疣粒野生稻分離得到的一種典型暗色有隔內(nèi)生

2、真菌，定殖在水稻根部，能夠促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)，并提高水稻抗生物和非生物脅迫能力。研究稻鐮狀瓶霉與水稻互作的分子機(jī)制有助于更好地利用該共生體系。
　　細(xì)胞自噬autophagy是在真核生物（從酵母到人類）中具有高度進(jìn)化保守性的一類亞細(xì)胞降解途徑，研究表明該過(guò)程與許多植物病原真菌的侵染有關(guān)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于研究細(xì)胞自噬過(guò)程是否影響稻鐮狀瓶霉在水稻中的定殖從而影響共生體系。本研究基于稻鐮狀瓶霉基因組序列測(cè)定結(jié)果，探索適用于稻鐮狀瓶霉的基因

3、功能研究的方法，并且對(duì)六個(gè)自噬相關(guān)基因的功能做了深入的分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1)自噬相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　根據(jù)酵母和稻瘟病菌自噬相關(guān)基因的氨基酸序列，在17種真菌（包括兩種卵菌）中找到細(xì)胞自噬過(guò)程和調(diào)節(jié)自噬過(guò)程的基因的同源序列，并對(duì)它們的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，著重對(duì)稻鐮狀瓶霉中自噬相關(guān)基因進(jìn)行詳細(xì)鑒定和分析。
　　2)探索稻鐮狀瓶霉中基因功能研究的方法
　　使用目的基因敲除的方法來(lái)研究稻鐮狀瓶霉中的基

4、因功能，探索并優(yōu)化適合稻鐮狀瓶霉的基因敲除體系。成功獲得HoATG1、HoATG5、HoATG7、HoATG8、HoATG12和HoATG16共6個(gè)自噬相關(guān)基因的缺失突變體。
　　3)六個(gè)基因均參與稻鐮狀瓶霉的細(xì)胞自噬過(guò)程
　　六個(gè)基因的缺失突變體均對(duì)饑餓敏感，通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),六個(gè)基因HoATG1、HoATG5、HoATG7、HoATG8、HoATG12和HoATG16的缺失突變體在饑餓誘導(dǎo)的條件下菌絲液

5、泡內(nèi)無(wú)自噬小體積累，細(xì)胞自噬過(guò)程被阻斷。
　　4)稻鐮狀瓶霉中不同基因同酵母、稻瘟病菌的保守性驗(yàn)證
　　稻鐮狀瓶霉中的HoATG5、HoATG8能夠回補(bǔ)稻瘟病菌突變體△Moatg5和△Moatg8的表型，證明兩個(gè)自噬基因與稻瘟病菌中的自噬基因具有結(jié)構(gòu)和功能上的同源性;通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻鐮狀瓶霉中HoAtg5-HoAtg3，HoAtg5-HoAtg16, HoAtg7-HoAtg8，HoAtg7-HoAtg12，HoA

6、tg8-HoAtg1之間能發(fā)生互作，結(jié)果與酵母中一致，說(shuō)明在稻鐮狀瓶霉中同樣有著保守的泛素樣蛋白結(jié)合系統(tǒng)。
　　5)自噬相關(guān)的三個(gè)基因?qū)λ竟采w系無(wú)影響
　　三個(gè)突變體△Hoatg5、△Hoatg7和△Hoatg8與水稻進(jìn)行共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，三個(gè)基因缺失突變體在促生效果上與野生型一致，說(shuō)明三個(gè)基因HoATG5、HoATG7和HoATG8與水稻促生無(wú)關(guān);三個(gè)突變體在水稻根部定殖的結(jié)果顯示，三者都能夠定殖在水稻根部并且產(chǎn)生典型