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1、抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一類(lèi)具有廣譜抗微生物活性的天然小肽類(lèi)物質(zhì),是先天免疫系統(tǒng)中重要的非特異性免疫因子。Piscidin一詞最初來(lái)源于Silphaduang等從雜交斑紋鱸(hybrid stripedbass,Morone.chrysops×M.saxatils)肥大細(xì)胞分離出的一種肽類(lèi)抗菌素,隨后的研究發(fā)現(xiàn),從鲆鰈類(lèi)獲得的抗菌肽pleurocidin,雜交斑紋鱸的moronecidin,歐洲
2、狼鱸(Dicentrarchus labrax)的ditentracin,斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)的epinecidin-1等,都具有和piscidin十分相似的氨基酸序列及其多肽結(jié)構(gòu)和功能,為α-螺旋、帶正電荷、兩性親和多肽,可以統(tǒng)稱(chēng)為piscidin。本論文以我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)——赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus akaara)和大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)為研究對(duì)象,克隆
3、得到兩種魚(yú)類(lèi)的piscidin類(lèi)抗菌肽基因,并分析其氨基酸序列組成和次級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),與piscidin家族其他成員進(jìn)行多序列比對(duì),并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),研究結(jié)果如下: 1、通過(guò)RT-PCR、3'RACE、5'RACE和測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù),從赤點(diǎn)石斑魚(yú)的頭腎和脾臟擴(kuò)增出piscidin-like抗菌肽序列,并進(jìn)行序列分析和蛋白特性預(yù)測(cè),結(jié)果顯示赤點(diǎn)石斑魚(yú)piscidin為帶正電荷的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu),成熟肽碳末端具有強(qiáng)陽(yáng)離子四肽的RR
4、RH結(jié)構(gòu),與斜帶石斑魚(yú)成熟肽碳末端一致,這種結(jié)構(gòu)有利于提高與細(xì)菌胞膜的結(jié)合能力,與piscidins家族其他抗菌肽序列相似性為59%-79%,一致性為45%-75%,其氨基酸序列和次級(jí)結(jié)構(gòu)符合piscidin抗菌肽家族的特征,表明從赤點(diǎn)石斑魚(yú)頭腎和脾組織克隆得到的piscidin-like抗菌肽基因是piscidin基因變體,屬于piscidins家族的新成員。 2、通過(guò)RT-PCR、3'RACE、5'RACE和測(cè)序等分子生物學(xué)
5、技術(shù),從大黃魚(yú)的頭腎和脾臟擴(kuò)增出piscidin-like抗菌肽序列,并進(jìn)行序列分析和蛋白特性預(yù)測(cè),結(jié)果顯示大黃魚(yú)piscidin成熟肽為帶正電荷的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu),成熟肽碳末端沒(méi)有石斑魚(yú)類(lèi)的RRRH結(jié)構(gòu),正電荷值比赤點(diǎn)石斑魚(yú)piscidin低,優(yōu)勢(shì)域碳末端也沒(méi)有鱸魚(yú)類(lèi)的XQQ模塊,與piscidins家族其他抗菌肽序列相似性50-77%,一致性41-70%,其氨基酸序列和次級(jí)結(jié)構(gòu)符合piscidin抗菌肽家族的特征,表明從大黃魚(yú)克隆
6、得到的piscidin-like抗菌肽基因是piscidin基因變體,屬乎piscidins家族的新成員。 3、利有CLUSTALW軟件對(duì)piscidin家族抗菌肽進(jìn)行多序列比對(duì),驗(yàn)證了其具有高度序列同源性,說(shuō)明生物體結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一。利用MEGA4.0軟件繪制了Piscidin抗菌肽家族與其它魚(yú)類(lèi)抗菌肽家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),驗(yàn)證了從赤點(diǎn)石斑魚(yú)和大黃魚(yú)克隆得到的基因?qū)儆隰~(yú)類(lèi)piscidin抗菌肽基因,且piscidin家族抗菌肽
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