HMg-CoA還原酶抑制劑瑞舒伐他汀對實驗性自身免疫性心肌炎作用的研究.pdf

1、背景
　　 心肌炎廣義是指心臟的炎癥狀態(tài)，是心臟病學(xué)最具代表性和挑戰(zhàn)性的臨床課題之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床上可有輕度呼吸困難、急性心衰，甚至猝死等多種臨床表現(xiàn)形式。年青人發(fā)病率較高，其中包括無癥狀患者，占40歲以下猝死病例的12％。雖然大多數(shù)心肌炎患者能夠恢復(fù)健康，但是部分遺傳易感性患者可逐步進(jìn)展為慢性心肌炎和擴(kuò)張性心肌病(DCM)，并伴有充血性心力衰竭。雖然心肌炎定義看似簡單，但是其診斷和治療仍然是臨床面臨的重大課題。

2、　　 構(gòu)建一種好的心肌炎實驗動物模型是進(jìn)一步研究其分子和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。用心肌肌球蛋白或心肌α-肌球蛋白重鏈的肽段或用心肌肌鈣蛋白Ⅰ與完全弗氏佐劑乳化后免疫遺傳易感性小鼠，構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)動物模型。該模型能夠很好的模擬人類急性發(fā)病期爆發(fā)性心肌炎和慢性發(fā)病期擴(kuò)張性心肌病心臟病理損害，并為研究心臟特異性免疫反應(yīng)和心肌炎癥損害提供了極好的實驗動物模型。這些實驗?zāi)Ｐ湍軌驗檠芯啃碌脑\斷方法和治療策略提供幫助。
　

3、　 目的
　　 本研究中，選用BALB/c小鼠構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，
　　 方法
　　 六周齡雌性BALB/c小鼠（野生型;體重13～18g，購自山東大學(xué)實驗動物中心）飼養(yǎng)在專門的無病原微生物的實驗動物中心。所有實驗動物操作流程均獲得實驗動物保護(hù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，并遵循山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗指導(dǎo)準(zhǔn)則。
　　 所有BALB/c小鼠被隨機(jī)分成4組，其中包括C組:正常對照組;L組:低劑量短肽組;M

4、組:中劑量短肽組;H組:高劑量短肽組。后3組小鼠共45只用特異的短肽免疫2次構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，特異的短肽來自小鼠心肌α-肌球蛋白重鏈(MyHc-α614-629[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH])。該短肽具有抗原性（純度≥98.75％，上海吉爾生物化學(xué)有限公司），先將其溶解在生理鹽水中，再與等體積完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）充分乳化。每只小鼠分別在試驗第0天和第7天背部皮下注射上述含有短肽的乳化劑共

5、2次。首次免疫后的第16天、21天和26天做心臟超聲檢查，心臟組織切片行蘇木素-伊紅染色及組織病理學(xué)評分;63天行Masson三原色染色，對間質(zhì)纖維化進(jìn)行評估。
　　 結(jié)果
　　 在實驗性自身免疫性心肌炎動物模型中，用小鼠心肌α-肌球蛋白重鏈來源的短肽和完全弗氏佐劑的乳化液免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)的心肌炎，其炎癥高峰期是在首次免疫后的第21天。第63天心肌組織中的炎癥基本消退，但是病理性重塑仍持續(xù)存在。
　　 結(jié)

6、論
　　 盡管實驗性自身免疫性心肌炎動物模型是人為構(gòu)建，但是該模型為在活體內(nèi)且無外源病原微生物感染的情況下，研究心肌炎發(fā)病機(jī)制和自身免疫損傷機(jī)制提供了很大的便利條件。通過研究實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，我們不僅可以了解自身免疫機(jī)制在心肌炎發(fā)病發(fā)展中所起到的作用，同時也為研究炎癥性心臟疾病的病理生理改變和開展新的免疫調(diào)節(jié)治療提供了可能性。另外，實驗性自身免疫性心肌炎也為提高炎癥性心肌病當(dāng)前及未來影像學(xué)檢查診斷的準(zhǔn)確性提供了潛在

7、的研究工具。
　　 HMG-CoA還原酶抑制劑在實驗性自身免疫性心肌炎急性期的作用
　　 背景
　　 心肌炎是心肌炎癥病變并伴隨后續(xù)的心肌組織損害性疾病，它可導(dǎo)致心源性猝死。其中大約10～20％有心肌炎組織病理學(xué)證據(jù)，臨床表現(xiàn)無特異性，部分患者甚至沒有臨床癥狀，由于病情遷延不愈最終轉(zhuǎn)化為擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)。心肌炎病因復(fù)雜，但在多數(shù)情況下是與腸道病毒感染有關(guān)，常見有柯

8、薩奇病毒B3、腺病毒與細(xì)小病毒B19。用心肌肌球蛋白皮下注射免疫易感嚙齒類動物，構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型(experimentalautoimmunemyocarditis，EAM)，該模型是人類心肌炎和擴(kuò)張型心肌病實驗動物模型。在病毒誘導(dǎo)的小鼠心肌炎模型中，心肌肌球蛋白是小鼠體內(nèi)主要的自身抗原。實驗表明，用純化的小鼠心肌肌球蛋白免疫誘導(dǎo)易感小鼠心肌炎發(fā)?。ㄔ跊]有合并腸道病毒感染的情況下），與用腸道病毒感染誘導(dǎo)的心肌炎心臟組織

9、病理損害相似。由BALB/c小鼠構(gòu)建的實驗性自身免疫性心肌炎模型為探討心肌炎發(fā)病機(jī)制和研發(fā)有效的治療藥物提供了良好的實驗平臺。他汀是一類羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑藥物，不僅具有降脂作用，而且還有多功能免疫調(diào)節(jié)作用，通過抑制可誘導(dǎo)的MHC二類分子和抗原遞呈細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)，以及促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞由Th1向Th2分化，可有效治療T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性疾病。他汀類藥物也能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能和微血管系統(tǒng)的完整，增加

10、一氧化氮生物利用度和抗氧化作用?；谒☆愃幬镏T多的有益作用，該實驗選用BABL/c小鼠構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎模型，來研究瑞舒伐他汀對心肌炎癥反應(yīng)程度、心肌細(xì)胞凋亡及心功能等方面的影響作用。
　　 目的
　　 1.研究瑞舒伐他汀對急性期心肌炎的影響作用。
　　 2.研究瑞舒伐他汀對心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響作用。
　　 3.研究瑞舒伐他汀對心肌炎小鼠心功能的影響。
　　 方法
　　

11、1.實驗性自身免疫性心肌炎動物模型和藥物治療
　　 雌性六周齡BABL/c小鼠飼養(yǎng)在特定無病原微生物的實驗動物中心內(nèi)，所有小鼠被隨機(jī)分成4組，分別是正常對照組(groupC)，低劑量瑞舒伐他汀組(groupL)，高劑量瑞舒伐他汀組(groupH)和非藥物治療的EAM組(groupN)。其中g(shù)roupL，groupH，groupN三組小鼠分別在試驗開始的首日和第七天，給予背部皮下注射200μg/200μl心肌肌球蛋白短肽，構(gòu)建實驗

12、性自身免疫性心肌炎模型。在小鼠首次免疫當(dāng)天，兩個藥物治療組groupL和groupH開始接受瑞舒伐他汀藥物治療。GroupN組小鼠僅接受生理鹽水灌胃，替代瑞舒伐他汀藥物灌胃治療。首次免疫后的第21天，進(jìn)行心肌炎急性期實驗分析研究。
　　 2.超聲心動圖
　　 測量完每只小鼠體重后，再將這些小鼠先麻醉，后經(jīng)胸做超聲心動圖檢測，分別測量收縮末期和舒張術(shù)期左室內(nèi)徑，通過儀器計算自動獲取左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率。
　　

13、 3.組織學(xué)檢查和心肌炎嚴(yán)重程度評估
　　 做完上述檢查后，安樂死所有實驗小鼠，測量小鼠心臟重量并計算心臟重量/體重(HW/BW)比值，將心臟標(biāo)本浸泡在福爾馬林中24小時，后經(jīng)石蠟包埋、切片，行蘇木素和伊紅染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)有單核細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞壞死區(qū)域為心肌炎病變區(qū)，用半定量分析法評價心肌炎癥區(qū)域占整個心臟的百分比。
　　 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測炎癥細(xì)胞因子
　　 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測各組小鼠血清中的白

14、介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。
　　 5.血清脂質(zhì)水平
　　 檢測21天血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TGs)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)濃度。
　　 6.TUNEL檢測
　　 TUNEL檢測心肌組織中的凋亡細(xì)胞。
　　 7.免疫組化染色
　　 免疫組化檢測活化的caspase3的表達(dá)。
　　 8.Westernblotting實

15、驗分析
　　 Westernblotting檢測活性的caspase8andcaspase9的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果
　　 1.瑞舒伐他汀對心臟重量/體重比值和血清脂質(zhì)水平的影響
　　 與正常對照組相比，在groupN組心臟重量/體重比值明顯增加;而在groupL、groupH組該比值明顯下降，說明瑞舒伐他汀治療能夠明顯抑制心臟重量的相對增加，并且治療效果呈劑量依賴性增強(qiáng)。21天各實驗組血清脂質(zhì)水平無統(tǒng)計

16、學(xué)差異。
　　 2.瑞舒伐他汀改善心功能情況
　　 首次免疫后第21天，心臟超聲圖像分析顯示，心肌炎小鼠心功能不全，經(jīng)瑞舒伐他汀治療可延緩心衰進(jìn)程。
　　 3.瑞舒伐他汀對炎癥范圍的影響和組織病理學(xué)評分
　　 首次免疫后第21天，實驗結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀能抑制炎癥細(xì)胞浸潤，減輕炎癥反應(yīng)程度和范圍，瑞舒伐他汀治療效果呈劑量依賴性加強(qiáng)。
　　 4.抑制炎癥因子的表達(dá)
　　 用ELISA試劑盒檢

17、測4組血清細(xì)胞因子，結(jié)果顯示瑞舒伐他汀能抑制心肌炎小鼠血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，且該作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。
　　 5.心肌細(xì)胞凋亡和心肌活性caspase3表達(dá)
　　 用TUNEL試劑盒檢測凋亡細(xì)胞的數(shù)量;免疫組化染色顯示，含有活性的caspase3蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞分布在炎癥區(qū)域，另外，許多淋巴細(xì)胞核內(nèi)也有活性的caspase3蛋白的表達(dá)。兩種染色方法均顯示，相對groupC，groupN、groupL和groupH三

18、組檢測到的凋亡細(xì)胞數(shù)量依次遞減，groupC組未見到兩種染色方法的陽性細(xì)胞。該結(jié)果顯示瑞舒伐他汀能抑制細(xì)胞凋亡。
　　 6.瑞舒伐他汀對細(xì)胞內(nèi)caspase表達(dá)的影響作用
　　 在心肌炎癥反應(yīng)高峰期也即首次免疫后第21天，檢測具有活性的caspase8和caspase9蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對治療組和正常對照組，上述兩種活性蛋白分子在非治療組小鼠的心肌組織中高表達(dá)，瑞舒伐他汀能呈現(xiàn)劑量依賴性下調(diào)這兩種活性蛋白分子的表達(dá)

19、水平。
　　 結(jié)論
　　 本研究首次表明，瑞舒伐他汀能夠通過抑制心肌炎性細(xì)胞的浸潤及促炎細(xì)胞因子的釋放、減少心肌細(xì)胞的凋亡來顯著干預(yù)實驗性自身免疫性心肌炎的進(jìn)程，改善左心室功能，減緩左心室重塑。
　　 HMG-CoA還原酶抑制劑在實驗性自身免疫性心肌炎慢性期的作用
　　 背景
　　 心肌炎是指心肌炎癥性病變及伴隨而來的心肌組織損傷，其病理損害表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞凋亡、壞死和心肌組織間質(zhì)纖維

20、化。心肌炎后期常常進(jìn)展為擴(kuò)張性心肌病(DCM)，臨床癥狀以心衰為主。許多臨床觀察和動物實驗結(jié)果均顯示自身免疫反應(yīng)在心肌炎的發(fā)病中起著重要的作用。
　　 實驗性自身免疫性心肌炎是感染后心肌炎實驗動物模型，該模型是通過給遺傳易感性小鼠免疫心肌肌球蛋白或者心肌α肌球蛋白重鏈來源的短肽或者心肌肌鈣蛋白Ⅰ誘發(fā)免疫性心肌炎發(fā)病而構(gòu)建的一類實驗動物模型。該動物模型已被證實其慢性期心肌病理損害和擴(kuò)張性心肌病臨床病理損害相似，也表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、心

21、室腔擴(kuò)張、彌漫性心肌纖維化、心肌細(xì)胞肥厚和萎縮性表現(xiàn)，類似于人類心肌病臨床表現(xiàn)和病理損害。我們選用易感的BALB/c小鼠構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，來研究由免疫誘導(dǎo)的心肌炎其慢性期的發(fā)病機(jī)制。
　　 3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通常稱為“他汀類藥物”，是一類眾所周知的強(qiáng)效調(diào)脂藥物。除了降脂作用外，他汀類藥物目前還被證實具有多種心血管保護(hù)作用，其中包括免疫調(diào)節(jié)，抗炎、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、延

22、緩細(xì)胞衰老、改善心肌重塑?；谏鲜鏊☆愃幬飳π难艿挠幸孀饔?，本研究旨在探討瑞舒伐他汀是否改善由BALB/c小鼠構(gòu)建的實驗性自身免疫性心肌炎慢性期病理損害和心肌重塑，進(jìn)而闡明該藥物的作用機(jī)理。
　　 目的
　　 1.評價瑞舒伐他汀對慢性期實驗性自身免疫性心肌炎的影響作用。
　　 2.探討瑞舒伐他汀對心肌炎心功能的影響作用。
　　 3.探討瑞舒伐他汀對心肌重塑，尤其是心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化發(fā)揮治療作用的

23、分子機(jī)制。
　　 方法
　　 1.實驗性自身免疫性心肌炎動物模型
　　 用心肌肌球蛋白α重鏈上具有抗原活性的短肽(MyHc-α614-629[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH])免疫六周齡BALB/c小鼠構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型（具體步驟同第一部分），將構(gòu)建好的動物模型分組:非藥物治療組(groupN);低劑量瑞舒伐他汀藥物治療組(groupL);高劑量瑞舒伐他汀藥物治療組(groupH);

24、剩余的BALB/c小鼠（既沒有接受免疫誘導(dǎo)構(gòu)建心肌炎模型，也沒用藥物治療）被劃分到正常對照組中(groupC)。
　　 2.瑞舒伐他汀藥物治療
　　 瑞舒伐他汀藥物治療與首次免疫誘導(dǎo)心肌炎同步進(jìn)行，也即從實驗開始的當(dāng)天到實驗結(jié)束的第63天，前后共9周時間，通過鼻飼管給小鼠灌胃注入瑞舒伐他汀，非藥物治療組和正常對照組小鼠予生理鹽水代替藥物灌胃。
　　 3.心臟超聲檢查
　　 各組小鼠是在首次免疫后的第21天

25、和第63天分別進(jìn)行心臟超生檢查，用二維M超獲取各組小鼠心臟超聲圖像和測量數(shù)據(jù)，胸骨旁長軸和短軸圖像分別在二尖瓣和左室乳突肌水平獲取。測量左心室舒張木期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑、舒張末期室間隔厚度和舒張木期左室后壁厚度，每個測量數(shù)值是通過測量3個心動周期取平均值而獲得。射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率通過計算獲得。
　　 4.心肌炎組織學(xué)評價
　　 心肌炎病理損害的嚴(yán)重性是在首次免疫后的第21天進(jìn)行評估，用蘇木素和伊紅復(fù)染心臟組織切片

26、，用半定量圖像分析法評估心肌炎癥損害程度。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附試驗測量炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平
　　 首次免疫后的第21天和第63天，用IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測量實驗小鼠血清中的IL-6和TNF-α濃度。
　　 6.心肌細(xì)胞肥厚和心肌組織纖維化的組織學(xué)評估
　　 在試驗第63天，也即實驗性自身免疫性心肌炎慢性期，將小鼠安樂死，制備心臟標(biāo)本，取5μm厚的心肌組織切片脫蠟進(jìn)行組織學(xué)分析，

27、HE染色評估心肌細(xì)胞肥厚，Masson三原色染色評估纖維化程度，天狼星紅染色評估膠原沉積。
　　 7.Westernblotting分析
　　 在心肌炎癥高峰期的第21天，采用Westernblotting分析法檢測pERK1/2、tERK1/2、pJNK、tJNK、p-p38及t-p38;在心肌炎癥慢性期的第63天用同樣方法檢測TGF-β1及pSmad2/3各蛋白表達(dá)水平的變化情況。
　　 結(jié)果
　　

28、1.瑞舒伐他汀對心肌結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　 心臟超聲顯示，心肌炎后左心室功能紊亂并伴有心肌重構(gòu)，相對于低劑量藥物治療組，高劑量瑞舒伐他汀藥物治療可明顯改善實驗性自身免疫性心肌炎小鼠左心室重構(gòu)并減緩心衰的進(jìn)程，而且連續(xù)治療63天能進(jìn)一步改善心肌炎小鼠的心功能。
　　 2.瑞舒伐他汀改善小鼠實驗性自身免疫性心肌炎的進(jìn)程
　　 在groupN組中，能夠觀察到嚴(yán)重的心肌炎癥損害。而在groupL和groupH組中，心肌炎

29、癥細(xì)胞浸潤明顯減少，組織病理學(xué)評分進(jìn)一步證實給予瑞舒伐他汀藥物治療能抑制心肌炎癥反應(yīng)，而且這種抑制作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。
　　 3.瑞舒伐他汀對血清中炎癥細(xì)胞因子的影響作用
　　 ELISA方法檢測四組小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，兩組瑞舒伐他汀藥物治療組(groupL、groupH)小鼠血清中IL-6和TNF-a較groupN組明顯下降，而且這種抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用隨瑞舒伐他汀藥物劑量的增加而增加。
　　 4

30、.瑞舒伐他汀對心肌重塑的影響
　　 顯著的間質(zhì)纖維化及膠原沉積在實驗性自身免疫性心肌炎各實驗組均能觀察到，然而瑞舒伐他汀藥物治療組較groupN組能明顯減少心肌間質(zhì)纖維化及膠原沉積的程度，且藥物劑量越大上述作用越強(qiáng)。
　　 5.瑞舒伐他汀對細(xì)胞內(nèi)信號激酶和分子的影響作用
　　 瑞舒伐他汀能呈劑量依賴性減少心臟p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、TGF-β1和p-Smad2/3的表達(dá)，該結(jié)果顯示瑞舒伐他汀能抑