血脂康抑制HMG-CoA還原酶反應(yīng)體系的建立及其在體內(nèi)外測定中的應(yīng)用.pdf

1、血脂康作為一種現(xiàn)代調(diào)脂中藥，已在中國上市，在美國已完成二期臨床試驗，即將進入三期臨床研究。FDA要求將血脂康活性檢測作為一項質(zhì)量控制標(biāo)準，且進入三期臨床時要進行血脂康與洛伐他汀片的生物利用度研究，因此，本課題將對血脂康的活性測定方法進行研究，通過建立并優(yōu)化 HMG-CoA還原酶抑制效應(yīng)體系，應(yīng)用于血脂康的體內(nèi)外活性研究中，為血脂康質(zhì)量控制及臨床用藥安全提供依據(jù)。
　　1.建立并優(yōu)化HMG–CoA還原酶促反應(yīng)條件及抑制效應(yīng)條件

2、>　　建立LC-MS/MS方法，用于測定HMG-CoA還原酶酶反應(yīng)產(chǎn)物—甲羥戊酸的含量，同時建立并優(yōu)化HMG-CoA還原酶體外酶促反應(yīng)條件及抑制效應(yīng)下的反應(yīng)條件，用于評價血脂康體外生物活性。
　　采用電噴霧離子源（ESI），負離子掃描，多反應(yīng)檢測（MRM），用于定量反應(yīng)產(chǎn)物甲羥戊酸，甲羥戊酸內(nèi)酯-d7為內(nèi)標(biāo)；10 mM甲酸銨:乙腈（70:30 v:v，pH8.0）為流動相，流速為800?L/min，分流。同時優(yōu)化HMG-CoA還原

3、酶量、NADPH量、HMG-CoA量、預(yù)孵育時間及反應(yīng)時間等因素，通過計算轉(zhuǎn)化率和抑制率確定最終優(yōu)化條件。當(dāng)HMG-CoA還原酶量為3.125×10-4 U，NADPH量為160 nmol，HMG-CoA量為5 nmol，反應(yīng)時間為50 min時，底物轉(zhuǎn)化率為25.54％，洛伐他汀酸濃度為10 ng/mL時有明顯抑制效應(yīng)。以此條件繪制抑制曲線，可根據(jù)曲線方程計算血脂康中發(fā)揮抑制HMG-CoA還原酶活性成分的含量。通過對HMG-CoA還原

4、酶反應(yīng)條件進行優(yōu)化，使所建方法精密度好，準確度高，可用于血脂康膠囊的生物活性測定。
　　2.血脂康體外活性測定
　　對已建立的HMG-CoA還原酶反應(yīng)抑制效應(yīng)體系進行相關(guān)方法學(xué)確證。洛伐他汀酸標(biāo)準曲線濃度范圍為10~500 ng/mL時抑制效應(yīng)顯著穩(wěn)定，準確度（CV）和精密度（RSD）范圍分別為95.28%~101.53%，7.08%~10.51%。
　　按照已優(yōu)化的HMG-CoA還原酶酶促條件，建立HMG-CoA還原

5、酶抑制效應(yīng)反應(yīng)體系并建立抑制曲線，根據(jù)曲線方程分別測得10批血脂康原料藥中洛伐他汀酸的含量范圍為4.84~6.54 mg/g；洛伐他汀（以洛伐他汀酸計）與洛伐他汀酸的總含量范圍為17.61~25.00 mg/g；10批血脂康膠囊中洛伐他汀酸的含量范圍為1.63~2.02 mg/粒；洛伐他汀（以洛伐他汀酸計）與洛伐他汀酸的總含量范圍為3.65~4.85 mg/粒。通過酶活法測定的結(jié)果顯著高于 HPLC法的測得值，推測血脂康中可能有其他成份

6、在同時發(fā)揮抑制 HMG-CoA還原酶的作用。血脂康的體外活性研究對于血脂康的質(zhì)量控制研究具有一定的指導(dǎo)意義，并對血脂康的體內(nèi)研究提供參考。
　　3.血脂康膠囊犬藥代動力學(xué)評價
　　建立Beagle犬血漿中洛伐他汀及洛伐他汀酸的LC-MS/MS方法和酶活檢測法，分別用兩法測定口服血脂康膠囊及洛伐他汀片后犬血漿中洛伐他汀及洛伐他汀酸的血藥濃度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計算主要藥動學(xué)參數(shù)，研究血脂康膠囊在犬體內(nèi)的藥動學(xué)行為，為臨床用藥提供試驗

7、依據(jù)。
　　LC-MS/MS法：血漿樣本經(jīng)固相萃取濃集后進樣，使用Venusil MP-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，i.d.，3μm），以2 mmol/L乙酸-乙酸銨（A）－乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，梯度流速恒定為0.45 mL/min，柱溫為35℃，進樣量10μL，總分析時間為6 min。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式分別進行正負離子監(jiān)測。洛伐他汀選用洛伐他汀-d3作為內(nèi)標(biāo)，在正離子模式下檢測；

8、代謝物洛伐他汀酸選用洛伐他汀酸-d3作為內(nèi)標(biāo)，在負離子模式下監(jiān)測。該分析方法快速，重現(xiàn)性好，靈敏度高，定量下限為0.5 ng/mL，線性范圍從0.5~500 ng/mL，精密度準確度符合相關(guān)要求，且內(nèi)源性物質(zhì)不干擾洛伐他汀與洛伐他汀酸的測定，血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)，冰水放置4 h，樣品經(jīng)處理后室溫放置24 h后均穩(wěn)定。
　　體外酶活檢測法：血漿樣品室溫解凍后，取200μL乙腈蛋白沉淀后，離心取上層濃縮干燥，殘留物用100μ

9、L緩沖液復(fù)溶，加入到HMG-CoA還原酶反應(yīng)體系中，生成的產(chǎn)物經(jīng)樣品前處理后，進 LC-MS/MS系統(tǒng)分析，LC-MS/MS檢測條件同測定血脂康體外活性的LC-MS/MS條件相同。通過產(chǎn)物量計算抑制率，從而表征體內(nèi)血脂康活性成分含量。酶活檢測法線性范圍為0.5~500 ng/mL，日內(nèi)、日間精密度（RSD）均小于20.10%，準確度（RE）在±20.32%以內(nèi)。
　　應(yīng)用上述建立的兩種方法分別測定不同時刻Beagle犬血漿中血脂康

10、的血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線。采用WinNonLin v5.2.1(Pharsight Inc.)軟件的非房室模型分析藥代參數(shù)。8只 Beagle犬分別口服給予血脂康膠囊和洛伐他汀片后，根據(jù)所測得的血藥濃度計算得到藥代參數(shù)如下：采用LC-MS/MS方法測得血脂康與洛伐他汀片的消除半衰期t1/2（均值±標(biāo)準差）分別為：3.70±1.58 h，4.49±2.57 h，藥時曲線下面積AUClast分別為：261.85±168.12，19

11、4.47±315.17；AUCall分別為264.02±169.15，209.05±314.61；Tmax分別是：1.38±0.69 h，1.50±0.53 h；Cmax分別是114.13±61.87 ug/mL，49.06±48.71 ug/mL。采用酶活方法測得血脂康與洛伐他汀片的消除半衰期t1/2分別為8.73±6.92 h，7.54±2.37 h，藥時曲線下面積 AUClast分別為446.13±175.2；432.83±370

12、.44；AUCall分別為478.18±170.5，472.42±384.15；Tmax分別是1.25±0.65 h，1.63±0.52 h；Cmax分別是135.36±29.94 ug/mL，107.76±44.28 ug/mL。
　　兩種測定方法均能滿足試驗要求且相關(guān)性良好。通過酶活法測得血脂康的體內(nèi)活性高于 LC-MS/MS方法，進一步說明血脂康中確實有其他成分在同時發(fā)揮著抑制HMG-CoA還原酶的活性，對臨床用藥安全具有一