β-catenin基因多態(tài)與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌易感.pdf

1、研究背景： 大量研究表明原發(fā)性肝細胞癌(HCC，肝癌)發(fā)生是一個多基因、多途徑的復(fù)雜多階段過程，基因的點突變、擴增、移位、重排及病毒基因的插入，引發(fā)原癌基因的激活和抑癌基因的失活，是肝癌發(fā)生的核心生物學(xué)過程。同時，肝癌的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳決定了個體遺傳易感性，而環(huán)境因素決定了什么樣的易感個體患癌。 腫瘤遺傳易感性最明顯的臨床特征是家族史，即在同一個家族的數(shù)代中，有多位腫瘤患者。遺傳性和散發(fā)性腫瘤都關(guān)

2、系到同一組癌相關(guān)基因，體細胞癌相關(guān)基因突變及其積累的速度，使具有不同遺傳多態(tài)性的個體，有不同中、低程度的腫瘤易感性。因此，腫瘤家族的臨床鑒定近年受到重視，癌家族可作為遺傳易感性的一種指標，同時還有助于闡明腫瘤病因、臨床處理、遺傳咨詢以及癌相關(guān)基因的鑒定。 流行病學(xué)調(diào)查和遺傳學(xué)研究均顯示：在原發(fā)性肝細胞癌家系中，乙型肝炎病毒(HBV)感染也呈家庭聚集現(xiàn)象，HBV與肝癌有密切關(guān)系。實驗研究結(jié)果證實：HBV DNA編碼的乙肝病毒X蛋白

3、(HBx)在HBV致癌過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。HBx具多項功能，通過影響Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在肝癌的發(fā)生機制中起到重要的作用。在肝癌組織中和癌旁組織中有多個Wnt信號途徑基因表達異常、基因突變。 β—catenin基因定位于人染色體3p21-22，基因全長23.2kb，有16個外顯子，編碼β—聯(lián)蛋白。β—聯(lián)蛋白是Wnt途徑的決定性成分。β—catenin、軸蛋白(AXIN)基因的突變能阻止β—聯(lián)蛋白的下調(diào)，激活Wnt途徑。對人

4、肝癌組織和癌旁組織的研究可檢測到β—catenin基因變異且存在于exon3的condons32～45之間。 但是既往研究或僅局限于作HBV、HCC的流行病學(xué)和(或)遺傳病學(xué)調(diào)查分析，或者僅專注于肝癌組織及癌旁肝組織廣泛基因篩查、蛋白表達的差異，所研究的病理樣本來源患者之間互無遺傳學(xué)/血緣關(guān)系，所篩查出的基因不一定互有關(guān)聯(lián)，也不能判斷篩出的相關(guān)基因變異是僅局限于肝臟組織，由HBx誘導(dǎo)產(chǎn)生，還是在HCC發(fā)生前就已經(jīng)存在的？宿主遺傳

5、基因多態(tài)性對個體發(fā)生HCC的危險度的影響？即具有那些遺傳背景的個體在慢性HBV感染情況下更易發(fā)生HCC。 研究目的： 把病毒學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)結(jié)合起來，通過針對有肝癌家族史和無肝癌家族史的乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者匹配，探討β—catenin宿主基因多態(tài)性與肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，尋找β—catenin基因序列中是否存在HBV相關(guān)HCC遺傳學(xué)標志—基因突變位點。 研究方法： 1、對符合病例入選標準，不含

6、排除標準中因素的乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者進行家系和流行病學(xué)調(diào)查，從中挑選出有肝癌家族史的患者和與其流行病學(xué)因素一致但無肝癌家族史的匹配者共24例(包括12例有肝癌家族史病例和12例與之相匹配的無肝癌家族史病例)。病例外周血樣本進行以下實驗步驟。 2、從外周血液標本中提取人基因組DNA。 3、針對β—catenin基因外顯子3(exon3)所在DNA片段設(shè)計并合成引物。 4、進行PCR擴增。 5、PCR擴增產(chǎn)

7、物目的條帶瓊脂糖凝膠中切膠和回收。 6、回收純化產(chǎn)物進行的基因測序。 7、統(tǒng)計分析，比對測序結(jié)果和患者的家系調(diào)查結(jié)果。 研究結(jié)果： 對入選的24例患者進行外周血中人DNA基因組提取后對目的片段進行了擴增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果在紫外線攝像儀照相可見目的條帶清楚，擴增產(chǎn)物大小符合796bp，DNA提取和DNA擴增的成功率達100％。切膠回收后在2％瓊脂糖凝膠上電泳結(jié)果樣本的雜帶已經(jīng)消失，呈現(xiàn)單一目的條帶且清

8、晰。24份樣本送基因測序均得到清晰的測序圖譜，樣本測序成功率為100％，得到各樣本所需研究分析的β—catenin基因exon3序列。 對測序結(jié)果進行分析比對可見，所有患者在SNP rs28931588、rs28931589位點均為“G”。有3例患者(A8、A24、A23)測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站Genebank相關(guān)網(wǎng)頁顯示的序列存在多個位點的突變：A24 condons33，37和41；A8condons35，37，39，40，

9、41，43，44，45和46；A23 condons32，37，39，43。 研究結(jié)論： 1、本課題是首次專門在中國南方地區(qū)乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者中，通過有和無肝癌家族史患者匹配、由外周血提取人基因組DNA來研究該地區(qū)β—catenin的宿主基因多態(tài)性與肝細胞癌易感的關(guān)系。 2、乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細胞癌患者中，無論有或無家族史者，在SNP rs28931588、SNP rs28931589發(fā)生頻率都低，