低氧條件下Stat3反義寡核苷酸對(duì)喉癌細(xì)胞系Hep-2化療增敏的分子機(jī)制.pdf

1、目的：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)信號(hào)通路在人類多種腫瘤中持續(xù)激活，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。本試驗(yàn)通過(guò)Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2，在模擬人體實(shí)體腫瘤低氧環(huán)境下檢測(cè)順鉑作用后細(xì)胞凋亡、周期及P-Stat3、HIF-1a(HIF-1)、VEGF等相關(guān)蛋白表達(dá)。探討低氧對(duì)Stat3及相關(guān)因子信號(hào)傳導(dǎo)的作用，以及低氧條件下Stat3反義寡核苷酸對(duì)化療的影響及作用機(jī)制。為研發(fā)高效低毒的抗癌藥物及化療輔助

2、藥物提出理論及方法學(xué)依據(jù)。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境處理：低氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件為37℃、5％CO2、2％O2、93％N2、飽和濕度，對(duì)照常氧培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5％CO2、20％O2、75％N2、飽和濕度。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2低氧3h、6h、12h、24h以及常氧對(duì)照組p-Stat3、HIF-1a、VEGF的表達(dá)。 2.流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞常氧和低氧條件下應(yīng)用濃度為0μg/ml、1μg/ml、3μg/ml

3、、5μg/ml順鉑對(duì)Hep-2細(xì)胞作用6h后凋亡率。 3.應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度(100、200、400nmol/L)Stat3AS-ON、Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染組，脂質(zhì)體組及未轉(zhuǎn)染組Hep-2細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞存活率。 4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Stat3 AS-ON(200nmol/L)轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞24h后低氧條件下順鉑(3μg/ml)作用6小時(shí)后細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達(dá)。

4、 結(jié)果： 1.低氧條件下p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)照組FI為1，3h、6h、12h和24h p-Stat3 FI值分別為1.04±0.03、1.12±0.03、1.16±0.05、1.12±0.05。HIF-1a對(duì)應(yīng)FI值為0.91±0.32、1.87±0.83、3.91±0.67、5.04±0.51。VEGF對(duì)應(yīng)FI值為1.06±0.14、1.08±0.14、1.71±0.26、2.20±0

5、.75。p-Stat3與已證實(shí)的與低氧密切相關(guān)的HIF-1a存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.589)，且p-Stat3的表達(dá)先于HIF-1a。表明p-Stat3對(duì)HIF-1a的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞凋亡率在順鉑濃度為0～5μg/ml范圍內(nèi)隨濃度上升而增加，1μg/ml順鉑作用低氧與常氧組細(xì)胞凋亡率無(wú)差異，而3μg/ml、5μg/ml順鉑同等濃度下低氧組腫瘤細(xì)胞凋亡率低于常氧組。表明低氧可以導(dǎo)致化療抵抗

6、和化療敏感性降低。 3.熒光顯微鏡下各濃度Stat3寡核苷酸轉(zhuǎn)染組均可見(jiàn)綠色熒光。脂質(zhì)體介導(dǎo)寡核苷酸轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染30min進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，1h后80％～90％細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)熒光，同時(shí)細(xì)胞漿中也有較強(qiáng)的熒光分布，2h后達(dá)90％以上。轉(zhuǎn)染24h后MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率隨Stat3 AS-ON濃度(0-400nmol/L)增加下降，與脂質(zhì)體對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，轉(zhuǎn)染100nmol/L、200nmol/L Stat3 S-ON后細(xì)胞存活

7、率與脂質(zhì)體對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而400nmol/L Stat3 S-ON對(duì)細(xì)胞亦有抑制作用與脂質(zhì)體對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4.應(yīng)用Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞24后，流式細(xì)胞檢測(cè)p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達(dá)下降，與對(duì)照組相比有顯著意義。 5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)低氧條件下Stat3 AS-ON聯(lián)合化療組細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯G0/G1期阻滯，S期、G2/M期細(xì)胞比例減小。Stat3 AS-ON組也出

8、現(xiàn)G0/G1細(xì)胞阻滯。 6.200nmol/L Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞24h后，3μg/ml順鉑作用于低氧條件6h，流式細(xì)胞檢測(cè)p-Stat3、HIF-1a、VEGF表達(dá)下降，對(duì)比Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染組、化療組、Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染+化療組、空白對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照組有顯著差異，細(xì)胞凋亡率增加，對(duì)比其余組別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)Pearson相關(guān)分析p-Stat3與HIF-1a、HIF-1a與VEGF、p-St

9、at3與VEGF表達(dá)及p-Stat3與凋亡率相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(相關(guān)系數(shù)r分別為0.884、0.667、0.783、-0.909)。 結(jié)論： 1.體外試驗(yàn)控制細(xì)胞低氧生存環(huán)境可檢測(cè)到在較短時(shí)間即出現(xiàn)p-Stat3的表達(dá)增高，喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2中存在由低氧激活的Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。低氧誘導(dǎo)的HIF-1a表達(dá)在時(shí)效上晚于Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提示Stat3參與HIF-1a激活過(guò)程。 2.在模擬近似人體實(shí)體腫瘤的低

10、氧情況下，通過(guò)Stat3AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后，阻斷Stat3通路，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷Stat3信號(hào)通路激活，HIF-1a、VEGF亦出現(xiàn)明顯下降。說(shuō)明Stat3通路是低氧誘導(dǎo)HIF-1激活所必須。在缺少Stat3激活的條件下VEGF激活受阻。 3.Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染可抑制Hep-2細(xì)胞活性，細(xì)胞存活率隨Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染濃度增加下降，但不能夠完全抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用也有一定限度

11、，而且400nmol/L Stat3 S-ON由于高濃度寡核苷酸的非特異性毒性作用對(duì)細(xì)胞增殖亦表現(xiàn)一定抑制作用?？梢?jiàn)寡核苷酸的低毒性、高特異性仍存在局限性。因此不能通過(guò)無(wú)限制的提高反義寡核苷酸的濃度來(lái)提高其殺傷腫瘤的作用。 4.低氧條件下順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡較常氧降低。低氧條件可造成Hep-2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，阻斷Stat3信號(hào)通路后細(xì)胞周期阻滯更為明顯。應(yīng)用Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞在低氧條件下可不增加順