補(bǔ)氣收澀法干預(yù)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的:補(bǔ)氣收澀類中藥是治療腫瘤的常用藥物，其治療作用與抑制腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成有關(guān)。補(bǔ)氣收澀法是基于“腫瘤休眠療法”等理念的一種中醫(yī)腫瘤治法，通過固護(hù)正氣、收攝癌毒，從而抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)腫瘤患者的生命周期，提高患者的生存質(zhì)量。本課題選擇臨床常用的中藥黃芪和仙鶴草作為研究的對(duì)象，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)氣收澀藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和人氣靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖能力、遷移能力及凋亡的影響，之后進(jìn)一步檢

2、測(cè)促血管生成因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)的情況，初步探究補(bǔ)氣收澀藥配伍對(duì)腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的影響及可能的作用機(jī)制，為后續(xù)研究及臨床治療用藥的選擇提供參考。
　　方法:建立肝癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型，采用血清藥理學(xué)方法，制備補(bǔ)氣收澀藥的含藥血清。用MTT比色法檢測(cè)補(bǔ)氣收澀藥含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞和HUVEC增殖能力的影響，然后采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞和HUVEC的侵襲及遷移能力的影響，用Weste

3、rn Blot和Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)各給藥組細(xì)胞的VEGF、MMP-2和TIMP-2等重要因子的蛋白和基因表達(dá)的情況。
　　結(jié)果:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:課題所研究的補(bǔ)氣收澀藥對(duì)的含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和遷移能力都有較為顯著的影響，與空白血清組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　應(yīng)用Transwell法檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞的侵襲遷移能力，各實(shí)驗(yàn)組藥物作用48h

4、后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同用藥組作用于HUVEC后，正置熒光顯微鏡下觀察Transwell小室下層，透膜的細(xì)胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而減少，與空白血清對(duì)照組比較具有明顯的差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且細(xì)胞形態(tài)也由梭形逐漸變?yōu)閳A形。表明各藥物組明顯降低了HUVEC的侵襲力，并呈一定的劑量依賴性。
　　應(yīng)用Transwell法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的侵襲遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組藥物作用48h后，正置熒光

5、顯微鏡下觀察Transwell小室下層，各實(shí)驗(yàn)組透膜的細(xì)胞數(shù)目相比較于空白血清對(duì)照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且細(xì)胞形態(tài)也由梭形逐漸變?yōu)閳A形。表明各藥物組明顯降低了HepG2細(xì)胞的侵襲能力，并呈一定的劑量依賴性。
　　應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表達(dá)狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞VEGF、MMP-2的蛋白表達(dá)減少，與空白血清組比

6、較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TIMP-2的蛋白表達(dá)增多，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　用Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞的MMP-2、TIMP-2的mRNA表達(dá)狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMP-2的mRNA表達(dá)減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TIMP-2的mRNA表達(dá)增多，

7、與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表達(dá)狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞VEGF、MMP-2的蛋白表達(dá)減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TIMP-2的蛋白表達(dá)增多，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　用R

8、ealtime-PCR技術(shù)檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞的VEGF的mRNA表達(dá)狀況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞VEGF的mRNA表達(dá)減少，與空白血清組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論:初步的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)補(bǔ)氣收澀藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力和遷移能力具有明顯的抑制作用，這可能是這些藥物在細(xì)胞層面上抑制腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制;補(bǔ)氣收澀藥降低了人肝癌細(xì)胞HepG2的MMP-2、TIMP-2、V

9、EGF等因子的蛋白及mRNA的表達(dá)水平，這可能是這些藥物在分子生物學(xué)層面上抑制腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　另外，補(bǔ)氣收澀藥對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖能力和遷移能力具有明顯的抑制作用，這可能是這些藥物在細(xì)胞層面上抑制血管生成的作用機(jī)制;另外，補(bǔ)氣收澀藥降低了血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF等因子的蛋白及mRNA的表達(dá)水平，這可能是這些藥物在分子生物學(xué)層面上抑制腫瘤血管生成的作用機(jī)制。
　　綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)初步表明，補(bǔ)氣收澀法對(duì)腫瘤的增