牦牛外周血單個核細胞（PBMC）抑制性消減cDNA文庫的構建以及重要功能分子的克隆分析.pdf

1、外周血免疫相關細胞及其分泌的功能分子，在免疫調節(jié)、抗微生物、抗腫瘤以及細胞信號傳導等方面發(fā)揮重要作用。脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA)作為絲裂原能激活淋巴細胞和單核細胞分泌一些細胞因子，這些因子的分泌受一個復雜的信號網(wǎng)絡調節(jié)，該網(wǎng)絡是由許多分子組成和參與。為篩選和發(fā)現(xiàn)一些新的免疫相關候選分子，研究其結構和功能以及參與免疫調節(jié)的作用機制，本研究應用抑制性消減雜交技術構建了經(jīng)ConA和LPS聯(lián)合刺激誘導的差異表達cDNA文庫，并篩選、

2、克隆和鑒定分析了重要功能基因。 本研究以牦牛外周血單個核細胞為材料，以誘導刺激細胞的RNA合成的cDNA為試驗組，以未經(jīng)誘導刺激的cDNA為對照組，經(jīng)消減雜交和抑制性PCR擴增，將其產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，轉化大腸桿菌JM109，構建了牦牛外周血單個核細胞消減cDNA文庫。從文庫中挑選陽性克隆進行PCR鑒定，其插入片段在200～1000bp之間。隨機選擇非重復的6個有效EST序列，以半定量PCR方法驗證其消減效率，

3、結果顯示均從消減文庫中擴增到目的片段，其中5個為誘導性差異表達分子，1個為誘導特異性表達分子，說明該文庫有較高的質量。文庫中有效EST序列的測序和生物信息學分析表明，初步獲得27條差異表達基因片段，其中3個克隆為未知功能的新基因片段序列，其余的克隆涉及蛋白質合成、翻譯和表達調控、信號轉導和細胞間通信、細胞凋亡、細胞和機體防御、物質轉運和代謝等功能分子，這些分子的克隆和發(fā)現(xiàn)對動物宿主分子免疫學創(chuàng)新性研究奠定了基礎。 本研究選擇文庫

4、中與趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素a原(ProTα)高度同源的兩個分子片段為研究對象。根據(jù)牛趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素α原(ProTα)全長基因設計引物，擴增、克隆和鑒定趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素α原(ProTa)這兩個與免疫和信號傳導相關的差異表達重要功能分子。DNA測序及其序列分析表明，克隆的CXCR4基因的開放閱讀框為1062 bp，編碼353氨基酸殘基的前體蛋白，與登錄的CXCR4基因cDNA序列同源性