含NDVF基因的MDV CV1988株轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、新城疫是由新城疫病毒引起的雞和火雞的一種急性高度接觸性傳染病.20世紀(jì)40年代就開(kāi)始使用新城疫疫苗,通常使用的疫苗為活病毒苗.但活疫苗會(huì)導(dǎo)致雞群產(chǎn)生輕微呼吸道癥狀,從而繼發(fā)細(xì)菌感染.這些疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短,必須進(jìn)行多次免疫接種;且雛雞具有較高的母源抗體,會(huì)干擾疫苗的免疫效果.因此,構(gòu)建重組病毒來(lái)表達(dá)與新城疫病毒免疫有關(guān)的抗原基因,試圖解決以上問(wèn)題.馬立克氏病是由馬立克氏病病毒引起的雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤病.馬立克氏病病毒

2、疫苗株被認(rèn)為是最有潛力的病毒載體之一,通過(guò)構(gòu)建表達(dá)外源基因抗原的多價(jià)活疫苗來(lái)誘導(dǎo)免疫達(dá)到預(yù)防禽病的目的.考慮多價(jià)重組疫苗的諸多優(yōu)點(diǎn),該試驗(yàn)利用馬立克氏病病毒的gB啟動(dòng)子控制新城疫病毒F基因的表達(dá)來(lái)構(gòu)建重組馬立克氏病病毒,使其能有效地預(yù)防新城疫和由馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株引起的馬立克氏病,且既可以避免病毒對(duì)外源啟動(dòng)子的排斥作用,又可以避免母源抗體的影響來(lái)提高疫苗對(duì)商品雞的免疫保護(hù)作用.根據(jù)GenBank己發(fā)表的新城疫病毒F48E9株F基因序

3、列,設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,以含有新城疫病毒F48E9株F基因的質(zhì)粒pzl/z2為模板,將擴(kuò)增的F基因(1 678bp)片段克隆到真核表達(dá)載體pIRES中,構(gòu)建成表達(dá)F基因的載體pIRESF.再根據(jù)GenBank己發(fā)表的載體pIRES基因序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,以載體pIRESF為模板將擴(kuò)增的包含F(xiàn)基因及其上游的內(nèi)含子和下游的polyA的2 900bpDNA片段,再克隆入包含馬立克氏病病毒的gB啟動(dòng)子的pBluescript Ⅱ SK載體中,并使

4、其克隆到gB啟動(dòng)子580bp的下游,最后將包含gB啟動(dòng)子和F基因表達(dá)盒3 500bp克隆到馬立克氏病病毒CVI988非必需區(qū)US10基因中,并命名為pUS10F.在試驗(yàn)中,我們選擇CVI988疫苗株作為病毒載體來(lái)構(gòu)建重組病毒,原因是致弱的MDVI型疫苗如CVI988,它們的免疫效果明顯優(yōu)于HVT,同時(shí)疫苗株MDVI型與vvMDV的抗原有較高的同源性,理論上可以比其他血清型更能誘導(dǎo)具有針對(duì)性的免疫應(yīng)答反應(yīng),特別是針對(duì)vvMDV和vv+MD

5、V.為進(jìn)一步提高重組病毒的表達(dá)水平,將成功構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)利用轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的基因組作為模板進(jìn)行PCR,結(jié)果說(shuō)明真核細(xì)胞中已有帶F基因的細(xì)胞存在,質(zhì)粒載體已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞DNA.間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體后的293T細(xì)胞可特異性地表達(dá)NDV的F基因,所表達(dá)基因的抗原性較好,能夠與抗DNV的標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng).從而說(shuō)明轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體中的基因表達(dá)盒可以在細(xì)胞中有效地表達(dá),為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型的