新孢子蟲NcGRA2蛋白的表達(dá)及其在ELISA診斷和免疫保護(hù)方面的研究.pdf

1、新孢子蟲?。╪eosporosis）是由犬新孢子蟲（Neospora caninum）寄生在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的原蟲病。該病在世界范圍內(nèi)流行廣泛，主要臨床癥狀是引起孕畜流產(chǎn)、死胎、弱胎，給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。目前還沒有有效的預(yù)防新孢子蟲病的特效藥物和疫苗來控制新孢子蟲病的發(fā)生。對新孢子蟲病作出早期診斷，及時(shí)隔離淘汰患病牛是避免新孢子蟲病大范圍流行的主要方法，此外對新孢子病疫苗的研究也是當(dāng)務(wù)之急。本研究基于新孢子蟲NcGRA2的研究，利用NcGR

2、A2重組蛋白建立對新孢子蟲病早期診斷的間接ELISA方法，并制備新孢子蟲NcGRA2重組蛋白亞單位疫苗和核酸疫苗，驗(yàn)證聯(lián)合免疫對BALB/c鼠的保護(hù)效果，為預(yù)防新孢子蟲病的發(fā)生提供科學(xué)基礎(chǔ)。
　　根據(jù)新孢子蟲NcGRA2基因序列，設(shè)計(jì)了一對引物，引物中含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。提取新孢子蟲Nc-1株總RNA，用RT-PCR擴(kuò)增NcGRA2完整ORF基因片段。進(jìn)行T-A克隆，把NcGRA2連接到T-vector pMD20載

3、體上，獲得重組質(zhì)粒pMD20T-NcGRA2，經(jīng)酶切鑒定確定陽性克隆。經(jīng)過測序和生物學(xué)分析，表明Nc-1株的NcGRA2基因與Ncliverpool株的序列100％一致，與弓形蟲TgGRA2氨基酸同源性49%。通過對NcGRA2基因編碼氨基酸進(jìn)行預(yù)測，表明NcGRA2蛋白具有良好的抗原性，穩(wěn)定性好，親水性好，有利于蛋白質(zhì)純化。
　　設(shè)計(jì)一對去掉新孢子蟲 NcGRA2基因 N端信號肽的引物用于擴(kuò)增NcGRA2t，以pMD20T-Nc

4、GRA2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將NcGRA2t連接到原核表達(dá)載體 pGEX-4T1上，構(gòu)建原核表達(dá)載體。經(jīng)過大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析，表明 NcGRA2t蛋白在培養(yǎng)物上清和包涵體內(nèi)都存在。經(jīng)過Western blot分析NcGRA2t蛋白能夠被犬感染新孢子蟲血清所識別。把NcGRA2t蛋白給BALB/c鼠注射制備了抗NcGRA2t多克隆抗體，經(jīng)試驗(yàn)NcGRA2t多克隆抗體能與新孢子蟲的裂解抗原反應(yīng)，但是不與弓形蟲裂解抗原

5、反應(yīng)。
　　基于 NcGRA2t作為診斷抗原建立診斷新孢子蟲病的間接 ELISA方法。NcGRA2t診斷抗原能檢測到感染新孢子蟲的鼠血清，不和感染弓形蟲的鼠血清反應(yīng)，表明ELISA方法能區(qū)別新孢子蟲感染和弓形蟲感染。NcGRA2t作為診斷抗原和NcSAG1t診斷抗原進(jìn)行了比較，對犬感染新孢子蟲血清進(jìn)行檢測，顯示NcGRA2t作為診斷抗原的間接ELISA方法能用于新孢子蟲病的早期診斷。應(yīng)用該 ELISA方法對現(xiàn)地樣本進(jìn)行了檢測，生活

6、在牧場的犬感染新孢子蟲的幾率要高于寵物犬。應(yīng)用NcGRA2t和NcSAG1t作為診斷抗原對某牧場的牛血清樣本進(jìn)行了檢測，用NcGRA2t診斷牛感染新孢子蟲的陽性率為15%，用NcSAG1t診斷牛感染新孢子蟲的陽性率為50%，其中NcGRA2t診斷為陽性的牛血清樣本全部為NcSAG1t診斷陽性。
　　用EcoRI和XhoI酶從pMD20T-NcGRA2載體上切下NcGRA2片段連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1上構(gòu)建pcDNA3.1

7、/NcGRA2重組質(zhì)粒。pcDNA3.1/NcGRA2經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi)，通過間接熒光抗體試驗(yàn)?zāi)軌驒z測NcGRA2蛋白的表達(dá)，說明pcDNA3.1/NcGRA2能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白，為新孢子蟲NcGRA2核酸疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
　　應(yīng)用NcGRA2t重組蛋白疫苗和pcDNA3.1/NcGRA2核酸疫苗給BALB/c鼠免疫，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG、IgG1和IgG2a體液免疫應(yīng)答，IFN-γ和IL-4細(xì)胞免疫應(yīng)答