ELISA法檢測(cè)腹瀉病人微小隱孢子蟲(chóng)血清IgG抗體的研究.pdf

1、隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)是一種屬于頂端復(fù)合物門(mén)的寄生性原蟲(chóng)，是Tyzzer于1907年首先在實(shí)驗(yàn)小鼠胃腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的(小鼠隱孢子蟲(chóng))，當(dāng)前認(rèn)為隱孢子蟲(chóng)種類有：微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)，小鼠隱孢子蟲(chóng)(C.muris)，火雞隱孢子蟲(chóng)(C.meleagridis)，貝利隱孢子蟲(chóng)(C.baileyi)，蛇隱孢子蟲(chóng)(C.serpentis)，魚(yú)隱孢子蟲(chóng)(C.nasorum)等，對(duì)人和大多數(shù)脊椎動(dòng)物造成感染的主要是微小隱孢子

2、蟲(chóng)。隱孢子蟲(chóng)引起的隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidiosis)是一種全球性的人畜共患寄生蟲(chóng)病，但直到80年代以后才逐漸引起重視。免疫力正常的人感染隱孢子蟲(chóng)后，雖可引起急性腹瀉，但常為自限性；免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者感染此蟲(chóng)后，則可引起嚴(yán)重胃腸炎并伴有水樣腹瀉，導(dǎo)致大量體液丟失而危及生命。該病已被確定為引起人腹瀉的六大病因之一。在艾滋病(AIDS)患者中感染率高達(dá)48％左右，長(zhǎng)期的嚴(yán)重腹瀉，是艾滋病病人的重要致死因素之一。

3、DuPont等報(bào)道小劑量(50％感染劑量ID50為132個(gè)卵囊)的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊足以引起血清呈陰性的健康自愿受試者感染。由于隱孢子蟲(chóng)卵囊體積微小(直徑4-6μm)、分布廣泛，常規(guī)氯化飲水消毒方法不能將其殺滅，故對(duì)人類公共衛(wèi)生造成很大威脅。國(guó)外暴發(fā)流行時(shí)有報(bào)告，多發(fā)生于病人或病牛接觸后的人群，或幼兒園和托兒所等集體單位。據(jù)估計(jì)，發(fā)生在美國(guó)威斯康星州Milwaukee的那次暴發(fā)中，超過(guò)400，000居民染上了水樣腹瀉，因此致死100多人，

4、危害非常大。所以，隱孢子蟲(chóng)病的研究是目前各國(guó)重點(diǎn)研究的寄生蟲(chóng)病之一。 自從發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)以來(lái)，許多研究者一直致力于該病的防治研究，但到目前為止，對(duì)該病還沒(méi)有有效的防治措施，因此對(duì)該病的早期診斷以及研究防治該病的疫苗就顯得尤為重要。正確的早期診斷能最大限度減少病人的死亡，控制該病的流行蔓延，減少損失。目前，實(shí)驗(yàn)室鑒定和檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)的主要方法有消化道粘膜活檢法、體外培養(yǎng)法、病原學(xué)檢查法(各種涂片染色、漂浮法或沉淀法等鑒別卵囊)、免疫學(xué)

5、檢查法及分子生物學(xué)檢查法。這些方法中或者給病人帶來(lái)痛苦(消化道粘膜活檢法)，或者費(fèi)時(shí)費(fèi)力難以控制(體外培養(yǎng)法)，或者敏感性和特異性不高(病原學(xué)檢查法)，或者需要特殊的儀器設(shè)備難以在基層推廣應(yīng)用(分子生物學(xué)檢查法)。作為免疫學(xué)檢查法之一的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器設(shè)備，易于標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)濟(jì)，特別是應(yīng)用堿性磷酸酶標(biāo)記，催化速度高，穩(wěn)定性高，容易交聯(lián)，底物穩(wěn)定，檢測(cè)本底低，是目前疾病臨床診斷最受青睞的檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)外

6、學(xué)者應(yīng)用ELISA在隱孢子蟲(chóng)診斷應(yīng)用方面進(jìn)行了大量的嘗試，取得了一定成果。然而，因隱孢子蟲(chóng)與其它原蟲(chóng)一樣，抗原成分復(fù)雜，真正有診斷意義的抗原成分在整個(gè)蟲(chóng)體中占的比例較少，并且隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)體小，獲取高純度的蟲(chóng)體抗原較難等因素影響了檢測(cè)的敏感性和特異性，限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，解決隱孢子蟲(chóng)特異抗原的問(wèn)題成為解決隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)與診斷的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。 研究者對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)各生活期中與致病和免疫有關(guān)的蛋白進(jìn)行了篩選，一致認(rèn)為表面抗原(CP2

7、3、CP15/60、CP15等)以其較強(qiáng)的免疫原性成為免疫診斷、免疫預(yù)防及免疫治療的靶抗原，其中的CP23更是以其在基因序列中的保守性、具有較強(qiáng)的免疫活性等特點(diǎn)從而成為微小隱孢子蟲(chóng)免疫診斷和疫苗研制研究的熱點(diǎn)。 本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)表達(dá)含有原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-23的大腸桿菌BL21(DE3)、純化重組CP23蛋白；用微小隱孢子蟲(chóng)卵囊全抗原和重組CP23抗原分別包被酶標(biāo)反應(yīng)板來(lái)檢測(cè)腹瀉病人血清中IgG抗體，以確定

8、隱孢子蟲(chóng)病在人群中的分布情況，為臨床診斷提供依據(jù)。 研究結(jié)果：1.用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了重組CP23蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了純化和復(fù)性；2.用全抗原-ELISA和rCP23-ELISA分別檢測(cè)腹瀉病人血清和濾紙浸出液來(lái)檢測(cè)抗微小隱孢子蟲(chóng)IgG抗體的陽(yáng)性率，顯示血清和濾紙浸出液的陽(yáng)性率沒(méi)有差別(X2值分別為0.0038和0.000052，P均＞0.05)；3.244例腹瀉病人血清中抗微小隱孢子蟲(chóng)IgG抗體的陽(yáng)性率用全抗原-ELISA和rC

9、P23-ELISA檢測(cè)分別為9.84％和11.48％，二者之間沒(méi)有差別(X2=0.90，P＞0.05)；4.不同性別腹瀉病人檢測(cè)陽(yáng)性率(rCP23-ELISA)，男性為12.59％，女性為9.90％，二者之間沒(méi)有差別(X2=0.42,P＞0.05)；5.學(xué)齡前兒童(＜7歲)和其他人群(≥7歲)檢測(cè)結(jié)果(rCP23-ELISA)顯示：二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=4.20，P＜0.05)，學(xué)齡前兒童陽(yáng)性率明顯增高。6.市區(qū)和郊區(qū)腹瀉病人的樣

10、本檢測(cè)(rCP23-ELISA)，結(jié)果，二者之間有差別(X2=4.24，P＜0.05)，郊區(qū)腹瀉病人陽(yáng)性率高。 結(jié)論：本研究通過(guò)重組DNA技術(shù)，成功表達(dá)了微小隱孢子蟲(chóng)CP23抗原，抗原提純后建立了檢測(cè)腹瀉病人血清中隱孢子蟲(chóng)IgG抗體的ELISA方法。并以卵囊全抗原作對(duì)照對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)兩者之間有很好的一致性，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他研究相符合，表明這兩種方法都可以用于人群中隱孢子蟲(chóng)病血清流行病學(xué)調(diào)查。但重組CP23抗原ELISA