1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ區(qū)的表達及其在血清學(xué)診斷和免疫保護方面的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來，隨著登革熱流行的日益嚴重，對登革病毒進行有效的防治是全世界共同關(guān)注的問題。本課題以登革病毒外膜基因DⅢ區(qū)(EDⅢ)為研究對象，進行診斷試劑盒的研制，同時構(gòu)建了3種類型的登革疫苗進行免疫保護的研究。 一、1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ區(qū)的表達及重組抗原在血清學(xué)診斷中的應(yīng)用 在大腸桿菌BL21(DE3)中分別克隆、表達1-4型登革病毒外膜蛋白基因DⅢ區(qū)，重組蛋白用電洗脫法進行純化。純化后的DEN1-4型重組蛋白分別

2、應(yīng)用于間接ELISA法檢測相應(yīng)型別DEN IgG抗體，以IFA為標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性為100％；DEN1型重組蛋白應(yīng)用于捕獲ELISA法檢測DEN1型感染者IgM抗體，不僅能檢出所有IFA法IgM陽性的標(biāo)本，而且還檢出了2份IFA法未能檢出的早期標(biāo)本：DEN1型重組蛋白應(yīng)用于夾心ELISA法檢測DEN1型感染者IgM/IgG總抗體，其敏感性為82.6％；以IFA為標(biāo)準(zhǔn)，三種方法的特異性均為100％。純化的重組蛋白混和后作為捕獲抗原制成金標(biāo)試劑

3、條，應(yīng)用于登革病毒感染者的檢測，與PanBio公司的金標(biāo)條檢測結(jié)果相比，兩者無顯著性差別。 二、登革疫苗的研制及免疫保護作用分析 1．1-4型登革病毒重組亞單位疫苗的研制及免疫原性分析利用連接肽(Gly-Gly-Ser-Gly-Scr)<,3>將DEN 1型與2型，3型與4型的EDⅢ基因片段連接在一起，構(gòu)建了EDⅢ融合基因的原核表達載體，在大腸桿菌中表達融合重組蛋白。重組蛋白經(jīng)高效液相色譜(HPLC)純化后免疫BALB/

4、c鼠，采用中和實驗法測定血清DEN1-4型中和抗體效價，其滴度分別為1：34.9、1：45.3、1：24．7、1：38.4。免疫血清分別與1-4型的登革病毒作用后，攻擊乳鼠，免疫血清對乳鼠保護率分別為100％、100％、83％、83％。 2．登革病毒EDⅢ融合基因真核表達載體的構(gòu)建及DNA在小鼠中的免疫原性觀察構(gòu)建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的真核表達載體，用間接免疫熒光法和Western blot法檢測重組真核

5、表達載體在BHK一2l細胞中的表達情況。結(jié)果表明，重組真核表達載體能在BHK-21細胞中表達目的蛋白。DNA質(zhì)粒免疫BALB/c鼠，采用中和實驗法測定血清DEN1-4中和抗體效價，其滴度分別為1：24.7、1：26.9、 1：13.4、 1：16.0。 3．EDⅢ融合蛋白及DNA質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠誘生中和抗體的分析將DⅢ融合重組蛋白及含有EDⅢ融合基因的DNA質(zhì)粒單獨或聯(lián)合免疫小鼠，觀察其對小鼠的免疫原性，比較誘生中和抗體的能力。

6、結(jié)果表明，聯(lián)合免疫組產(chǎn)生的中和抗體效價顯著高于重組蛋白免疫組及DNA免疫組，同時蛋白免疫組與DNA免疫組比較，中和抗體也表現(xiàn)為增高。 4．登革病毒EDⅢ區(qū)融合基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定采用腺病毒表達系統(tǒng)，構(gòu)建DEN1/2型、DEN3/4型EDⅢ融合基因的重組腺病毒表達載體，并且在293A細胞系中包裝成具有感染性的重組腺病毒，病毒滴度可達10<'9>PFU/ml。重組腺病毒感染哺乳動物細胞后，用間接免疫熒光法和Westernb