MD-2在內(nèi)毒素跨膜信號轉(zhuǎn)導中的作用及其與TLR4、CD14之間的關(guān)系.pdf

1、單核及巨噬細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞,通過分泌多種細胞因子等調(diào)節(jié)對入侵病原體的反應,但是過強的反應,尤其是嚴重創(chuàng)傷及大手術(shù)后等,機體的免疫機能下降的情況下,可出現(xiàn)膿毒癥(Sepsis)、膿毒性休克.高達50﹪的膿毒癥病人是由革蘭陰性菌感染所致,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),即內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的主要致病成分;極微量內(nèi)毒素即可使機體首先通過天然免疫系統(tǒng)對其做出反應.機體免疫細胞對LPS 的識別機制極為復

2、雜,1990年發(fā)現(xiàn)的CD14是LPS的識別受體,但由于CD14分子沒有跨膜部分,自身不能將信號導入細胞內(nèi),還需要其它膜結(jié)合分子協(xié)同作用.TLR4及MD-2蛋白的發(fā)現(xiàn)是對LPS受體識別機制研究的突破性進展,MD-2與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián),因其是一個只含有160個氨其酸的分泌蛋白,具有分子量小,核酸片段短,且為可分泌型等特點,對MD-2的調(diào)控更易于操作,因而成為治療內(nèi)毒素休克十分有潛力的靶點之一.研究其在內(nèi)毒素跨膜信號轉(zhuǎn)導中的作用及其與T

3、LR4、CD14之間的關(guān)系,是確定對MD-2進行調(diào)控有無深遠意義的基礎(chǔ).LPS對人外周血單核巨噬細胞的活化有賴于其受體基因的表達譜,雖然有一些對CD14,TLR4基因表達受LPS調(diào)節(jié)的報道,但報道的結(jié)果并不一致,且很少有對MD-2基因受LPS調(diào)節(jié)的報道;更沒有同時報道MD-2/TLR4/CD14基因在同一標本內(nèi)受LPS調(diào)節(jié)的研究.核糖核酸酶保護法是一種可同時在同一標本內(nèi)檢測多種基因表達的先進方法,且其重復性、客觀性都較強,但是需要構(gòu)建相

4、關(guān)基因的檢測模板組,因而該研究率先構(gòu)建了該檢測模板組,并成功地應用于檢測人外周血單核細胞上關(guān)注的三種基因的表達.為進一步明確MD-2在單核細胞LPS信號轉(zhuǎn)導中的作用,可以通過增強或抑制其功能的方式,檢測細胞LPS信號功能的變化,從而反映其作用,并為確定可否做為調(diào)控靶點提供相應的實驗的依據(jù).通過基因轉(zhuǎn)染的方法將MD-2或其功能突變體導入受體細胞,可使細胞增強表達MD-2或阻抑MD-2的功能.因而,我們首先根據(jù)相關(guān)報道,成功地構(gòu)建了MD-2

5、的功能失活表達載體,而后將正常功能的MD-2表達載體及新構(gòu)建的功能突變體導入人單核細胞株THP1內(nèi),觀察對LPS效應的影響.為明確MD-2所起的作用的機制及其與TLR4及CD14之間的關(guān)系,通過觀察它們與LPS的結(jié)合能力及不同組合的轉(zhuǎn)染細胞對LPS的不同反應能力,以探討MD-2發(fā)揮其作用的可能機制.因此擬從以下三部分進行研究:1.分離提取人外周血單核細胞,以LPS刺激,核糖核酸酶保護法檢測MD-2、TLR4、CD14 mRNA表達變化的

6、規(guī)律.2.構(gòu)建MD-2功能突變體,將正常功能的MD-2及其功能失活突變體轉(zhuǎn)染進單核細胞株THP1內(nèi),以LPS刺激后,觀察細胞活化功能的變化,以此反映MD-2在LPS信號轉(zhuǎn)導中所起的作用.3. 將以上三種基因表達質(zhì)粒以不同組合轉(zhuǎn)染HEK293細胞,而后應用LPS刺激轉(zhuǎn)染細胞,觀察細胞NF-kB被活化的改變,及熒光素標記的LPS與轉(zhuǎn)染細胞的結(jié)合能力,以此來探討MD-2發(fā)揮其作用的可能機制.主要結(jié)果及結(jié)論如下:一、成功地構(gòu)建了用于核糖核酸酶保

7、護法的模板組:為在基因水平檢測MD-2/TLR4/CD14表達變化奠定了基礎(chǔ).核糖核酸酶保護法具有靈敏度高,穩(wěn)定性及重復性好等特點,因而構(gòu)建了該模板組,并成功地用于檢測人外周血單核細胞上述三種基因的表達.二、人外周血單核細胞上述三種基因的表達規(guī)律:人外周血單個核細胞在受到LPS刺激后,TLR4, MD-2, CD14 mRNA在刺激后15min~30min即可以明顯增加,在1-3h則有一過性降低,之后恢復.檢測結(jié)果提示:細胞作為對LPS

8、的反應,迅即增強相關(guān)受體基因的表達,但作為機體自我保護的一種反應,為避免過強的炎癥反應,能反饋性的適當抑制和調(diào)節(jié)LPS受體基因的表達.另外,因三者的表達豐度存在明顯的差異,由于缺乏更多的證據(jù),我們只能推測表達最低的MD-2可能在LPS信號中具有更為特異的作用.三、構(gòu)建了MD-2功能突變體:根據(jù)相關(guān)文獻報道,在人MD-2蛋白分子的第95位氨基酸,在由半胱氨酸突變?yōu)槔野彼岷蠊δ苁Щ?我們應用PCR定點突變的方法成功地構(gòu)建了該突變體.四、MD

9、-2可調(diào)節(jié)細胞對LPS的反應能力:轉(zhuǎn)染正常功能的MD-2表達載體后,THP1細胞NF-κB活性及細胞上清內(nèi)TNF-α分泌增強.相反,轉(zhuǎn)染MD-2的功能突變體后,LPS對THP1細胞激活效應明顯減弱,表現(xiàn)為NF-κB活性及TNF-α分泌明顯降低.進一步提示,MD-2在LPS對單核細胞的激活效應中具有重要的地位,而且有望成為調(diào)節(jié)炎癥反應強度的靶點之一.五、MD-2可明顯增強細胞經(jīng)TLR4對LPS的結(jié)合能力:單獨或以各種不同的組合方式將三種受

10、體基因轉(zhuǎn)染進HEK293細胞內(nèi),以FITC-LPS與細胞共同孵育,應用流式細胞儀的方法進行檢測,發(fā)現(xiàn)MD-2可以直接與LPS結(jié)合,雖然這種結(jié)合能力較低,但是卻可以明顯促進LPS與TLR4及CD14的結(jié)合.六、在LPS對細胞NF-kB的活化過程中,需要MD-2/TLR4/CD14三種分子的共同參與.雖然MD-2可明顯促進TLR4與LPS的結(jié)合,且TLR4/MD-2共同轉(zhuǎn)染后細胞對LPS有較強的結(jié)合能力,但是與三種基因共同轉(zhuǎn)染的細胞相比,細

11、胞活化程度較低.沒有跨膜蛋白TLR4的參與,CD14/MD-2也有一定強度的與LPS的結(jié)合能力,可是細胞卻不能被LPS活化.同樣,沒有MD-2的調(diào)節(jié)作用,轉(zhuǎn)染TLR4/CD14的細胞與LPS的結(jié)合能力僅及單獨轉(zhuǎn)染CD14的細胞,更不能被LPS所活化.提示在LPS跨膜信號傳導中,MD-2及TLR4為必不可少的蛋白分子;只有在三種蛋白分子同時表達于細胞膜時,才能達到最大的信號活化強度;推測MD-2蛋白可能作為一種調(diào)節(jié)分子,能改變跨膜蛋白TL