剛性基因連接的功能化膽酸二聚體衍生物的合成及離子傳輸活性.pdf

1、離子跨膜傳輸在生物體系中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)一些通道類疾病，例如跨上皮傳輸受損或囊泡功能受損引起的疾病發(fā)揮著重要作用。因此，對(duì)離子跨膜傳輸?shù)难芯坎粌H有助于我們了解天然離子通道的生物功能，而且，在新藥開發(fā)方面也具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
　　 由于天然的離子通道種類繁多，結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，通常在生理?xiàng)l件下發(fā)揮作用，且對(duì)pH和溫度敏感，因而限制了天然通道蛋白的更廣泛的實(shí)際應(yīng)用。因此，研究者們希望通過合成一些結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的化合物來模擬天然離子通

2、道的結(jié)構(gòu)特征和功能。設(shè)計(jì)合成人工離子通道的首要目的之一在于闡明化合物在膜中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子所應(yīng)具備的結(jié)構(gòu)要素，并且獲得調(diào)控通道分子性能的方法。
　　 一個(gè)化合物要具備離子傳輸活性需要具備兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)要求。首先，無論是單分子還是聚集體形成的通道，其長(zhǎng)度要與磷脂雙分子層的厚度相匹配;其次，化合物具有兩親性，親脂性部分與磷脂分子的烴基鏈相互作用使通道分子插入膜中，而通道的內(nèi)部應(yīng)是相對(duì)親水的，協(xié)作離子跨膜傳輸。
　　 目前，大多已報(bào)

3、道的非肽類人工離子通道都是以一些兩親性分子為模板來設(shè)計(jì)合成的，如環(huán)糊精、冠醚、杯芳烴等。在這些骨架分子中，甾醇類化合物，尤其是膽酸分子表現(xiàn)出了很大的優(yōu)勢(shì)。這主要是由其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的，它親脂性的甾環(huán)可以與磷脂分子的烷基鏈相互作用，為在膜中構(gòu)建穩(wěn)定的孔道提供了一個(gè)剛性的骨架結(jié)構(gòu)，而羥基部分則可以為離子提供一個(gè)相對(duì)親水的孔道以便其通過。此外，膽酸分子的長(zhǎng)度與磷脂分子的長(zhǎng)度相匹配。因此，以適當(dāng)基團(tuán)連接的膽酸二聚體能夠橫跨整個(gè)磷脂雙分子層。

4、正因?yàn)槿绱?，有一些膽酸二聚體衍生物被設(shè)計(jì)合成出來，并表現(xiàn)出較好的離子傳輸活性。但是，這些化合物除了膽酸單元上的羥基和兩個(gè)膽酸單元的連接基團(tuán)（如酯或氨基甲酸酯）外，沒有其他的功能團(tuán)參與與離子之間的相互作用。因此，本文在膽酸二聚體上引入其它功能團(tuán)，協(xié)助離子進(jìn)行跨膜傳輸，從而調(diào)控離子傳輸性能。
　　 基于以上設(shè)計(jì)理念，本研究設(shè)計(jì)合成了一類由剛性基團(tuán)連接的膽酸二聚體1-3。在這三個(gè)化合物中，兩個(gè)膽酸單元用剛性的對(duì)苯二胺或?qū)Ρ蕉装愤B接，

5、可以使整個(gè)分子采取伸展的構(gòu)型，有利于分子在膜中形成跨膜的結(jié)構(gòu)，而分子的中間帶有氨基或乙酰氨基作為通道分子的附加功能團(tuán)。由于功能團(tuán)位于分子結(jié)構(gòu)的中間，當(dāng)分子插入膜中后，功能團(tuán)會(huì)隨之一起進(jìn)入膜中并位于分子所形成的通道內(nèi)，從而更好地調(diào)節(jié)化合物對(duì)離子的傳輸作用。另外，為了更好地探究功能團(tuán)的作用，本研究還合成了沒有附加功能團(tuán)的化合物4。
　　 化合物1-3是通過以下方法合成的:首先，用1-羥基苯并三唑(HOBT)/二環(huán)己基碳二亞胺(DCC

6、)方法活化膽酸-賴氨酸綴合物，并與對(duì)苯二胺或?qū)Ρ蕉装愤M(jìn)行?；磻?yīng)后，再用三氟乙酸(TFA)脫去叔丁氧羰基(Boc)，分別得到了化合物1和2。再將化合物2在THF的水溶液中用乙酸酐酰化，得到化合物3。而化合物4則是以膽酸為原料，經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化并與對(duì)苯二甲胺反應(yīng)得到的二聚體?；衔?-4的結(jié)構(gòu)用氫譜、電噴霧質(zhì)譜以及高分辨質(zhì)譜確認(rèn)。
　　 然后以卵磷脂形成的脂質(zhì)體為模型，以熒光強(qiáng)度對(duì)pH變化敏感的熒光黃為指示劑，

7、用熒光光譜法詳細(xì)研究了各二聚體的離子傳輸活性和陽離子選擇性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1-4的離子傳輸活性均有濃度依賴性，說明這四個(gè)化合物都有離子傳輸能力。其中，有功能團(tuán)修飾的化合物1、2和3的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力高于不具有功能性基團(tuán)的化合物4。從離子傳輸活性與濃度依存關(guān)系實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)化合物1、2和4由四個(gè)分子在膜中形成具有離子傳輸能力的活性結(jié)構(gòu)，而化合物3則是由兩個(gè)分子形成。堿金屬陽離子選擇性實(shí)驗(yàn)表明，化合物1和2對(duì)堿金屬陽離子選擇性為Na+＞Li+

8、＞K+≈Rb+≈Cs+;當(dāng)將化合物2的氨基乙?；椿衔?）或無附加功能團(tuán)（即化合物4）時(shí)，陽離子選擇性為L(zhǎng)i+＞Na+＞K+≈Rb+≈Cs+。這個(gè)結(jié)果表明，當(dāng)將氨基乙酰化后，通道分子對(duì)堿金屬Li+和Na+的選擇性出現(xiàn)了反轉(zhuǎn)，即通過對(duì)該類膽酸二聚體結(jié)構(gòu)修飾可以調(diào)控其離子傳輸性能。另外堿金屬陽離子選擇性實(shí)驗(yàn)也說明，通道分子對(duì)堿金屬陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)是整個(gè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程的限速步驟，結(jié)合氯離子傳輸實(shí)驗(yàn)可知，化合物1-4的離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理可能為氫離子和鈉