免疫OBR胞外近跨膜區(qū)蛋白對SD大鼠糖、脂代謝的影響.pdf

1、背景：隨著人們健康保健意識的提高，逐漸意識到肥胖不單純是體重超標，也是亞健康甚至是病態(tài)表現(xiàn)，同時也是Ⅱ型糖尿病、心血管病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、骨質(zhì)疏松、中風和癌癥等多種疾病的高危誘發(fā)因素。引起肥胖的原因有很多。原因:運動不足、基因缺陷、營養(yǎng)過剩等。減肥、瘦身和纖體成為當今社會健康保健和臨床醫(yī)學、美容的時髦話題。目前的減肥方法有很多，比如針灸療法，運動療法、藥物的療法等。但是這些治療的方法在不同程度上都存在一些條件局限性或?qū)θ藗兊?/p>

2、健康造成危害。雖然運動療法較為有效，但容易受到時間、空間、環(huán)境因素的制約。所以人們希望尋求一種更為安全、有效的減肥方法。上世紀80年代，美國科學家證實瘦素及其受體功能異常是導(dǎo)致部分人肥胖的罪魁禍首之一。瘦素(Leptin)基因也稱OB基因（肥胖基因）、瘦素主要是由白色脂肪組織分泌，是反應(yīng)體內(nèi)脂肪儲存和營養(yǎng)狀況的信號。Leptin可影響機體的許多生理和代謝過程，參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量平衡。近年來，有研究者

3、發(fā)現(xiàn)，注射瘦素可以治療肥胖，但對瘦素受體功能異?；蚴菟氐挚沟幕颊呤菬o效的。本課題組利用瘦素免疫SD大鼠，產(chǎn)生的瘦素抗體中和了內(nèi)源性瘦素的作用，從而模擬了瘦素抵抗作用，大鼠出現(xiàn)了肥胖癥狀，促進脂肪沉積，減弱了胰島分泌胰島素的功能。Brown等[2]在遠系雜交的小鼠中運用cDNA片斷序列分析發(fā)現(xiàn)瘦素受體基因第12外顯子一個鳥苷酸殘基缺失，導(dǎo)致編碼序列框架移碼，使Leptin受體轉(zhuǎn)導(dǎo)水平降低10倍，此位點為糖尿病位點的1個等位基因，小鼠出現(xiàn)糖

4、尿病和肥胖。既然瘦素是通過激活位于細胞表面的瘦素受體發(fā)揮抑制脂肪沉積作用，本實驗設(shè)想能否把瘦素受體作為肥胖、糖尿病治療的新靶點。瘦素受體(leptin receptor)基因也稱OBR基因。OBR在豬的多個組織器官上都有表達，如腦、小腸、卵巢、腎、脾、肝臟、垂體、心肌、肺等，其中下丘腦、腎臟、肝臟表達最強[3]。瘦素只有與位于下丘腦及脂肪組織的OBR結(jié)合，才可發(fā)揮降低食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用。已有研究表明利用

5、受體蛋白片段免疫，產(chǎn)生的抗體可以結(jié)合到受體胞外區(qū)，并可能產(chǎn)生抑制或促進效應(yīng)。根據(jù)不同的片段、不同的動物，抗體可能激活OBR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而增強leptin功能的發(fā)揮，或者阻礙OBR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而抑制leptin功能的發(fā)揮[4]。如果抗體阻礙OBR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而抑制leptin功能的發(fā)揮，可以促進脂肪沉積，導(dǎo)致動物肥胖及代謝綜合癥的發(fā)生。如果受體上某個區(qū)域肽片段產(chǎn)生的抗體激活OBR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而增強leptin功能的發(fā)揮，抑制脂肪生長沉積，這將更好地改善動

6、物肉質(zhì)及控制肥胖。在畜牧業(yè)上利用瘦素受體重組融合蛋白免疫法調(diào)控畜禽生產(chǎn)育肥和增加瘦肉率已取得很好效果。施振旦[5]等把瘦素受體蛋白片段制成疫苗免疫雞，采食量、體重、脂肪沉積降低。因此我們探討是否可以利用瘦素受體抗體與瘦素受體特異性結(jié)合，來模擬瘦素加強瘦素受體及相關(guān)調(diào)控基因的功能，從而抑制脂肪沉積和血糖水平。瘦素通過與瘦素受體結(jié)合后發(fā)生一系列神經(jīng)元反應(yīng)，影響POMC基因與NPY基因表達，最終抑制食欲。POMC基因與NPY基因的生物學作用是

7、相互拮抗的，因而它們對食欲的調(diào)控最為關(guān)鍵。另外，本課題還關(guān)注與脂肪代謝相關(guān)的兩個基因PPARγ和UCP3，PPARγ對脂肪組織中甘油三酯水解的限速酶CPT-1進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[6]。CPT-1的表達水平與體脂含量相關(guān)，表達水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低體脂肪沉積量[7]。UCP3基因是脂肪代謝的候選基因，UCP3基因在脂肪代謝過程中，使得骨骼肌中乙酰輔酶A羧化酶濃度降低，這樣降低骨骼肌丙二酸單酰輔酶A的濃度，從而從抑制狀態(tài)釋放CPT1，

8、提高β氧化，從而完成其調(diào)節(jié)脂類代謝的功能。
　　 目的：肥胖是多種疾病的高危誘發(fā)因素。尋找減肥的方法已刻不容緩。美國科學家發(fā)現(xiàn)瘦素及瘦素受體功能異常是導(dǎo)致部分人肥胖的原因。Leptin可影響機體的許多生理和代謝過程，參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量平衡。Leptin通過激活位于細胞表面的受體OBR發(fā)揮抑制脂肪沉積的生物學作用。瘦素及瘦素受體功能異?？蓪?dǎo)致糖脂代謝的異常。在畜牧業(yè)上利用瘦素受體重組融合蛋白免

9、疫法降低雞體重、脂肪沉積降低已取得很好的效果。因而本課題利用瘦素受體胞外進跨膜區(qū)重組融合蛋白主動免疫SD大鼠，探討能否利用OBR抗體與OBR特異性結(jié)合的能力，來模擬Leptin加強OBR及相關(guān)調(diào)控基因的功能，從而抑制脂肪沉積和降血糖，為研發(fā)預(yù)防和治療肥胖癥及相關(guān)代謝性疾病（Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝等）藥物奠定實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法：⑴PCR擴增克隆瘦素受體胞外近跨膜區(qū)基因片段，并將其插入到大腸桿菌表達質(zhì)粒pRSETA

10、。⑵大腸桿菌BL21(DE3)株中用IPTG誘導(dǎo)各表達菌表達表達瘦素受體胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白;②鑒定:western-blotting定性檢測純化的瘦素受體胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白。③純化:用50％Ni-NTA樹脂利用親和層析在變性條件下純化目的蛋白，經(jīng)尿素和pH梯度透析逐步除去尿素，并將蛋白溶解于PBS中。⑶按常規(guī)方法制成油乳劑疫苗。將大腸桿菌中表達并純化瘦素受體胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白與礦物油等佐劑在勻漿器中混勻制備基因工程疫苗

11、⑷挑選30只體重均勻、健康的40日齡SD大鼠♀，隨機分為2組，每組15只，單籠飼養(yǎng)，預(yù)飼5d后進行正式實驗。供試SD大鼠在整個實驗期間給予普通鼠料，自由采食、自由飲水。⑸實驗全期按免疫次數(shù)分成3個階段:以第一次免疫前一天記為第0天，于第1天進行第一次免疫，第20天、40天加強免疫。免疫采用腿肌兩側(cè)兩點注射方法，處理組(OBR-a)每只每次免疫1mg瘦素受體胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白，對照組(KLH)免疫1mgKLH蛋白。⑹分別在實驗的第0

12、、7、14、20、27、34、40、47天對大鼠進行采血和對采食量、體重和體長進行測定，并計算Lee's指數(shù)（衡量大鼠肥胖程度的重要指標）。采血后分離血清用于抗體水平、血清葡萄糖、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、瘦素、胰島素、膽囊收縮素的測定。第49天每組隨機挑選6只大鼠進行耐糖量測試，在第50天時將所有大鼠安樂死，分離腹脂、肝臟稱量鮮重并計算腹脂率、肝臟指數(shù)。采集肝臟檢測組織甘油三酯含量。采肝臟制作冰凍切片（油紅O染色

13、）和采皮下脂肪制作石蠟切片（HE染色），胰腺制作石蠟切片后進行胰島素免疫組化檢測。采集下丘腦、垂體、腿部肌肉、肝臟進行脂肪沉積、攝食相關(guān)基因(UCP3、PPARγ、POMC、NPY)的熒光定量PCR檢測。⑺動物試驗所得的所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理。體重、采食量、體長、Lee's指數(shù)采用two-way ANOVA進行統(tǒng)計分析;其他用平均數(shù)±標準差表示，采用Student's t test進行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異顯

14、著。
　　 結(jié)果：①通過提取西藏小型豬肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行OBR胞外近跨膜區(qū)基因片段PCR擴增并成功構(gòu)建OOBR胞外近跨膜區(qū)原核表達載體;成功誘導(dǎo)表達純化西藏小型豬OBR胞外近跨膜區(qū)蛋白。②免疫SD大鼠后，體重、體長、Lee's指數(shù)、腹脂率、肝臟脂肪沉積、胰島素分泌、血糖、胰島素、血脂四項與對照組無明顯差異;而采食量顯著增加(p＜0.05)、皮下脂肪細胞體積縮小。另外，免疫OBR胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白組的大鼠血清中CC

15、K的含量比對照組高，且差異顯著(P＜0.05); CCK生理功能是抑制食欲，與瘦素共同反饋調(diào)節(jié)下丘腦的飽食中樞。理論上實驗組大鼠相對與對照組食欲應(yīng)該更差。但實際情況并非如此，免疫OBR胞外近跨膜區(qū)重組融合蛋白組的大鼠采食量比對照組的高。③瘦素通過與瘦素受體結(jié)合，發(fā)生一系列神經(jīng)元反應(yīng)，最終抑制食欲。本實驗利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了免疫了OBR的SD大鼠體內(nèi)最為關(guān)鍵的兩個與食欲相關(guān)的基因——POMC和NPY。結(jié)果表明，免疫OBR-a后，S

16、D大鼠POMC基因的表達量低于對照組，NPY基因表達量高于對照組。POMC基因與NPY基因的生物學作用是相互拮抗的，POMC基因表達越低與NPY基因表達越高，促進食欲的效果更好[8]。免疫OBR-a后，SD大鼠體內(nèi)leptin含量降低會導(dǎo)致食欲的增加。這與本實驗中對SD大鼠測定的采食量數(shù)據(jù)相吻合。免疫OBR-a后，在實驗后期SD大鼠的采食量均高于對照組。④免疫OBR-a后，皮下脂肪細胞體積縮小，另外熒光定量PCR結(jié)果顯示，調(diào)控脂肪沉積的

17、PPARγ和UCP3基因均上調(diào)，且PPARγ的表達量與對照組差異顯著(p＜0.05)。PPARγ是通過調(diào)控脂肪代謝過程中的某些酶的表達，促進脂肪的分解代謝。UCP3基因通過使呼吸鏈中的氧化與磷酸化作用解偶聯(lián)，降低ATP合成效率，使貯存的能量以熱能形式釋放。兩者最終都是促進代謝，減少脂肪沉積。這也與實驗中統(tǒng)計到的腹脂肪率、皮下脂肪沉積數(shù)據(jù)一致。在實驗第50天，對免疫OBR-a的SD大鼠腹脂進行分離，稱重并計算腹脂率;對皮下脂肪進行HE染色

18、，觀察脂肪細胞大小變化。結(jié)果顯示，免疫OBR-a的大鼠腹脂率、皮下脂肪細胞大小低于對照組。
　　 結(jié)論：對SD大鼠免疫OBR-a后，產(chǎn)生了抗OBR-a抗體，促進了瘦素與瘦素受體的結(jié)合，進而促進了與脂肪代謝相關(guān)基因——UCP3和PPARγ的表達，促進了能量代謝，減少了脂肪沉積，導(dǎo)致體內(nèi)leptin含量的降低，leptin含量的降低導(dǎo)致POMC基因表達的減少、NPY基因表達的增多，最終導(dǎo)致食欲的增強。若利用這些特點改進實驗設(shè)計，在限