間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)自體免疫性葡萄膜炎眼部Th17細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的:葡萄膜炎是眼科常見的自體免疫性疾病，Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，在包括葡萄膜炎在內(nèi)的多種自體免疫性疾病(autoimmunedisease，AID)中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一種具有免疫抑制特性的多能成體干細(xì)胞，在體內(nèi)外可抑制多種免疫細(xì)胞的增殖和功能。本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性自體免疫性葡萄膜炎(experimentalautoimmuneuveoretini

2、tis，EAU)模型，觀察MSCs對(duì)EAU免疫調(diào)節(jié)作用，檢測(cè)Th17細(xì)胞及其分泌的主要炎性因子IL-17在眼部的動(dòng)態(tài)變化，以闡明MSCs對(duì)EAU的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為臨床治療葡萄膜炎提供新的方法和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.MSCs培養(yǎng)：分離培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的表型。
　　2.EAU模型制作：Lewis大鼠75只，隨機(jī)實(shí)驗(yàn)組70只，空白對(duì)照組5只。光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(in

3、terphotoreceptorretinoid-bindingprotein，IRBP)R16片段與含有結(jié)核桿菌素HR37a2.5g/L的弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合充分乳化，單后足墊皮下注射免疫實(shí)驗(yàn)組大鼠建立EAU動(dòng)物模型。
　　3.MSCs治療：EAU造模后隨機(jī)分為模型對(duì)照組和MSCs治療組各35只。MSCs治療組分別于免疫的同時(shí)和EAU發(fā)病高峰期行MSCs尾靜脈注射治療，連續(xù)三天，模型對(duì)照組注射等體積PBS。
　

4、　4.臨床觀察：免疫后第4天，每日在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼部炎癥反應(yīng)，并根據(jù)Caspi臨床分級(jí)進(jìn)行評(píng)分。
　　5.組織病理學(xué)觀察：免疫同時(shí)治療組及模型對(duì)照組分別于免疫后第6，9，12，15，20天；EAU高峰期治療組分別于免疫后第15，20天，處死大鼠并摘除單側(cè)眼球制備視網(wǎng)膜組織切片，HE染色后行組織病理學(xué)觀察，參照Caspi組織學(xué)分級(jí)法進(jìn)行評(píng)。
　　6.免疫組織化學(xué)染色：取制備好的視網(wǎng)膜切片，免疫組化SP法檢測(cè)各組相應(yīng)時(shí)

5、間點(diǎn)視網(wǎng)膜組織中IL-17的表達(dá)。
　　7.房水采集及檢測(cè)：大鼠麻醉后，30G針頭行雙眼前房穿刺取房水，ELISA法檢測(cè)房水中IL-17的表達(dá)。
　　8.眼部浸潤(rùn)細(xì)胞提取及Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞檢測(cè)：大鼠麻醉后，行冷PBS心臟灌注，摘除各組大鼠單側(cè)眼球，分離眼部細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+IL-17+細(xì)胞和CD4+CD25+foxp3+細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離并鑒定MSC。
　　2.成功

6、建立EAU動(dòng)物模型。
　　3.與對(duì)照組相比，免疫同時(shí)(0天)和免疫后12天行MSCs治療，大鼠眼部臨床表現(xiàn)均顯著減輕(P<0.05)；視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變與臨床表現(xiàn)變化一致，MSCs治療后視網(wǎng)膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)和組織結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，各時(shí)間點(diǎn)組織病理學(xué)均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色顯示，0天MSCs治療組于免疫后6，9，12，15，20天，12天MSCs治療組于免疫后15，20天，大鼠眼視網(wǎng)膜IL

7、-17蛋白陽性表達(dá)的平均A值均顯著低于相應(yīng)模型對(duì)照組(P<0.05)。
　　5.房水IL-17ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：與相應(yīng)模型對(duì)照組相比，0天和12天MSCs治療組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)房水中IL-17表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)。
　　6.眼部浸潤(rùn)細(xì)胞流式檢測(cè)顯示，與相應(yīng)模型對(duì)照組相比，0天和12天MSCs治療組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)眼部Th17細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。
　　結(jié)論：