間充質(zhì)干細(xì)胞在自體免疫性葡萄膜炎中作用的研究.pdf

1、目的:
　　 葡萄膜炎是一類最常見的眼部自體免疫性疾病，其中多種類型具有反復(fù)發(fā)作、并發(fā)癥多、治療困難以及預(yù)后較差和致盲率較高等特點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stom cells，MSCs）能夠抑制多種免疫細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞）的增殖和功能。本研究采用MSCs治療大鼠實(shí)驗(yàn)性自體免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmunc uveoretinitis，EAU），檢測

2、MSCs在患有葡萄膜炎的大鼠體內(nèi)能否發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，以及其可能的作用機(jī)制，試圖為臨床治療葡萄膜炎提供新的思路以及可供選擇的治療方法。
　　 方法:
　　 1.原代培養(yǎng)Lewis或Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，達(dá)90％融合時傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞的表型，并做體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
　　 2.使用光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（interphotoreccptor retinoid-bi

3、ndingprotdu，IRBP）與含有結(jié)核桿菌H37RA的完全弗氏佐劑等體積混合，充分乳化后，在雙后足部皮下免疫Lewis大鼠，24小時內(nèi)經(jīng)腹腔注射百日咳毒素，制作大鼠EAU動物模型。將動物隨機(jī)分組，為了觀察在免疫同時輸注MSCs對EAU的預(yù)防作用以及MSCs對已經(jīng)發(fā)生的EAU的治療作用，從不同時間開始連續(xù)三天（免疫后0，1，2天，EAU發(fā)生前；免疫后第9，10，11天，EAU初發(fā)期；免疫后第12，13，14，EAU高峰期；及免疫后第

4、16，17，18天，EAU慢性期）靜脈輸注自體或異體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，空白對照組輸注PBS。裂隙燈下定期進(jìn)行臨床觀察，20天后進(jìn)行病理學(xué)觀察，參照Caspi分級對臨床體征和病理學(xué)改變進(jìn)行評分，觀察葡萄膜炎的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸情況。
　　 3.收集各組大鼠脾臟以及腹股溝淋巴結(jié)，分離單個核細(xì)胞，在IRBP刺激下孵育72小時后，采用BrdU試劑盒檢測各組大鼠免疫應(yīng)答強(qiáng)度。
　　 4.取IKBP刺激下各組大鼠脾臟和淋巴結(jié)單個核細(xì)胞孵育

5、72小時后的上清液，采用ELISA試劑盒檢測Th1類和Th2類細(xì)胞因子分泌情況。
　　 5.免疫20天后取大鼠外周血，流式細(xì)胞儀測定CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。
　　 6.收集各組大鼠脾臟以及淋巴結(jié)，分離單個核細(xì)胞，提取總RNA，采用RT-PCR測定FOXP3 mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功分離并鑒定MSCs。
　　 2.建立了EAU動物模型。
　　

6、 3.采用MSCs治療EAU，與對照組相比，免疫的同時、免疫后第9天及免疫后第12天給EAU大鼠輸注MSCs后，臨床癥狀均顯著減輕（P<0.05），在免疫同時注射MSCs的預(yù)防效果尤為明顯，而免疫后第16天，在疾病慢性期注射MSCs則無作用（P>0.05）。與臨床表現(xiàn)一致，除外免疫后第16天注射MSCs組，病理學(xué)顯示其他三組實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損害明顯較對照組輕（P<0.05）。
　　 4.體外和體內(nèi)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，MSCs

7、可以顯著抑制致病性T細(xì)胞增殖（P<0.05）。
　　 5.ELISA結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Th1細(xì)胞因子分泌顯著降低（P<0.05），而Th2細(xì)胞因子分泌升高（P<0.05），表明MSCs可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答平衡，導(dǎo)致Th1向Th2應(yīng)答漂移。
　　 6.與對照組相比，MSCs治療組大鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著增高（P<0.05），實(shí)時定量PCR檢測也發(fā)現(xiàn)FOXP3-mRNA在MSCs治療組表達(dá)量顯著高于對照組（P<0.05），這些