乳腺癌生物樣本中內源性雌激素的代謝輪廓以及代謝組學的LC-MS-MS分析方法研究.pdf

1、本論文探索并建立了基于UFLC-MS/MS聯(lián)用技術的乳腺癌尿液中16種雌激素類代謝物的代謝輪廓分析方法，并結合多變量數(shù)據(jù)處理方法與RRLC-MS/MS技術，開展了乳腺癌血樣的代謝組學研究。通過雌激素類成分的代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)雌激素類代謝物的代謝途徑存在著不平衡狀態(tài)，其中2-,4-羥基化途徑起著主導作用，而16α-羥基化為次要途徑，該結果與醌介導的致癌機制相符合。同時研究表明，雌酮(E1)，雌二醇(E2)及其羥基化產物2-OHE2和4-O

2、HE2可能為致癌性分子標志物，而2-MeOE2可能是潛在的抑癌分子標志物。另外，在乳腺癌血樣的代謝組學研究中，發(fā)現(xiàn)了37個在乳腺癌患者與健康者血樣中存在顯著性差異的小分子代謝物，即可能的生物標志物。因此，將乳腺癌患者生物樣本中雌激素類的代謝輪廓與代謝組學分析相結合，可能有利于發(fā)現(xiàn)更多的特異性小分子生物標志物，獲得更全面、完整的代謝物變化信息，有助于了解及闡明乳腺癌的發(fā)病機制及機體內代謝途徑的變化，為乳腺癌的診斷提供重要依據(jù)。
　　

3、 本論文的研究內容主要包括以下3個部分:
　　 1.雌激素類代謝物的UFLC-MS/MS分析方法研究
　　 本研究采用正離子檢測模式的UFLC與QTRAP型MS/MS聯(lián)用技術，開展了尿液中16種代表性雌激素及其代謝物的LC-MS分析方法研究。首先，根據(jù)雌激素類及其代謝物存在其成分結構非常相似、樣本基質復雜及所含成分痕量等特點，開展了酶解、固相萃取法(SPE)，丹酰氯衍生化反應等樣品處理方法的考察，以及基于LC-MS/M

4、S的MRM掃描方法的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了適合于尿液中16種雌激素類代謝物同時定量分析的快速UFLC-MS/MS分析方法。另外，從方法的專屬性、靈敏度、基質效應、回收率、準確度、精密度以及穩(wěn)定性等各個方面進行了細致考察驗證，結果表明本方法可靠、有效，靈敏度高，精密度良好，能夠滿足尿液中16種內源性雌激素及其代謝物在16min內同時定量分析的需求。
　　 2.乳腺癌尿液中雌激素類成分的代謝輪廓分析研究
　　 在上述建立的UFLC

5、-MS/MS分析方法的基礎上，開展了對169例乳腺癌患者和76例健康女性尿液中16種常見雌激素類成分的代謝輪廓分析研究。按照健康情況和絕經情況的不同，在數(shù)據(jù)分析過程中，將尿液樣本分為以下四組進行了系統(tǒng)考察分析:分別為40例絕經前健康女性(H-PRE)、36例絕經后健康女性(H-POST)、83例絕經前乳腺癌患者(BC-PRE)、86例絕經后乳腺癌患者(BC-POST)。首先經MRM掃描模式的定量分析，獲得尿液中16種雌激素類的代謝輪廓譜

6、，并采用肌酐值校正的方法對尿液濃度進行了歸一化處理，然后進行均值含量的比較，以及t-檢驗的統(tǒng)計分析。由于絕經前女性體內雌激素代謝水平受月經周期特征等因素的影響波動太大;而絕經后女性體內雌激素的水平相對較低，且較為穩(wěn)定，因此本研究重點比較分析了絕經后乳腺癌患者與健康女性之間的雌激素水平變化，考察其與乳腺癌發(fā)生機制的相關性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者體內E1、E2及其羥基化產物2-OHE2和4-OHE2含量顯著增加;而16α-OH

7、E1和2-MeOE2含量顯著降低。進一步結合雌激素的代謝途徑和致癌機制，發(fā)現(xiàn)雌激素的代謝途徑存在著不平衡狀態(tài)，這與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關系。乳腺癌患者體內高水平的前體物質(E1和E2)之間可以協(xié)同作用，增加了自發(fā)突變率，造成直接的遺傳毒性，最終將增加乳腺癌發(fā)生的風險。2-,4-羥基化途徑起著主導作用，尤其來自E1和E2羥基化反應的2-OHE2和4-OHE2是最為關鍵的兩個代謝產物，通過醌類物質的介導，促進了癌細胞的增生，誘導了乳腺

8、癌的發(fā)生。此外，2-MeOE2可以抑制腫瘤細胞的快速增生，降低基因毒效應，體現(xiàn)了甲基化的解毒作用。而16α-羥基化途徑起著次要作用，16α-OHE1水平的變化與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展可能沒有密切關系。因此，綜合分析認為E1，E2，2-OHE2和4-OHE2為可能的致癌性分子標志物，而2-MeOE2可能是潛在的抑癌分子標志物;它們在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。本項結果對乳腺癌的早期診斷、篩查、預防等具有重要的應用價值。
　　

9、 3.基于RRLC-MS/MS方法的乳腺癌血樣代謝組學研究
　　 采用正、負離子檢測模式相結合的RRLC與QTOF型MS/MS聯(lián)用技術，結合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法，開展了乳腺癌血樣的代謝組學研究。作為乳腺癌體內雌激素代謝輪廓分析及其雌激素類標志物的補充，通過對72例乳腺癌患者和81例健康女性血漿樣本的代謝組學研究，旨在發(fā)現(xiàn)更多的特異性小分子生物標志物，獲得更全面、完整的代謝物變化信息，從而為揭示乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展機制提供豐富及可靠