乳腺癌生物樣本中內(nèi)源性雌激素的代謝輪廓以及代謝組學(xué)的LC-MS-MS分析方法研究.pdf

1、本論文探索并建立了基于UFLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)的乳腺癌尿液中16種雌激素類(lèi)代謝物的代謝輪廓分析方法，并結(jié)合多變量數(shù)據(jù)處理方法與RRLC-MS/MS技術(shù)，開(kāi)展了乳腺癌血樣的代謝組學(xué)研究。通過(guò)雌激素類(lèi)成分的代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)雌激素類(lèi)代謝物的代謝途徑存在著不平衡狀態(tài)，其中2-,4-羥基化途徑起著主導(dǎo)作用，而16α-羥基化為次要途徑，該結(jié)果與醌介導(dǎo)的致癌機(jī)制相符合。同時(shí)研究表明，雌酮(E1)，雌二醇(E2)及其羥基化產(chǎn)物2-OHE2和4-O

2、HE2可能為致癌性分子標(biāo)志物，而2-MeOE2可能是潛在的抑癌分子標(biāo)志物。另外，在乳腺癌血樣的代謝組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)了37個(gè)在乳腺癌患者與健康者血樣中存在顯著性差異的小分子代謝物，即可能的生物標(biāo)志物。因此，將乳腺癌患者生物樣本中雌激素類(lèi)的代謝輪廓與代謝組學(xué)分析相結(jié)合，可能有利于發(fā)現(xiàn)更多的特異性小分子生物標(biāo)志物，獲得更全面、完整的代謝物變化信息，有助于了解及闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及機(jī)體內(nèi)代謝途徑的變化，為乳腺癌的診斷提供重要依據(jù)。
　　

3、 本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下3個(gè)部分:
　　 1.雌激素類(lèi)代謝物的UFLC-MS/MS分析方法研究
　　 本研究采用正離子檢測(cè)模式的UFLC與QTRAP型MS/MS聯(lián)用技術(shù)，開(kāi)展了尿液中16種代表性雌激素及其代謝物的LC-MS分析方法研究。首先，根據(jù)雌激素類(lèi)及其代謝物存在其成分結(jié)構(gòu)非常相似、樣本基質(zhì)復(fù)雜及所含成分痕量等特點(diǎn)，開(kāi)展了酶解、固相萃取法(SPE)，丹酰氯衍生化反應(yīng)等樣品處理方法的考察，以及基于LC-MS/M

4、S的MRM掃描方法的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了適合于尿液中16種雌激素類(lèi)代謝物同時(shí)定量分析的快速UFLC-MS/MS分析方法。另外，從方法的專(zhuān)屬性、靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、準(zhǔn)確度、精密度以及穩(wěn)定性等各個(gè)方面進(jìn)行了細(xì)致考察驗(yàn)證，結(jié)果表明本方法可靠、有效，靈敏度高，精密度良好，能夠滿(mǎn)足尿液中16種內(nèi)源性雌激素及其代謝物在16min內(nèi)同時(shí)定量分析的需求。
　　 2.乳腺癌尿液中雌激素類(lèi)成分的代謝輪廓分析研究
　　 在上述建立的UFLC

5、-MS/MS分析方法的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了對(duì)169例乳腺癌患者和76例健康女性尿液中16種常見(jiàn)雌激素類(lèi)成分的代謝輪廓分析研究。按照健康情況和絕經(jīng)情況的不同，在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，將尿液樣本分為以下四組進(jìn)行了系統(tǒng)考察分析:分別為40例絕經(jīng)前健康女性(H-PRE)、36例絕經(jīng)后健康女性(H-POST)、83例絕經(jīng)前乳腺癌患者(BC-PRE)、86例絕經(jīng)后乳腺癌患者(BC-POST)。首先經(jīng)MRM掃描模式的定量分析，獲得尿液中16種雌激素類(lèi)的代謝輪廓譜

6、，并采用肌酐值校正的方法對(duì)尿液濃度進(jìn)行了歸一化處理，然后進(jìn)行均值含量的比較，以及t-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析。由于絕經(jīng)前女性體內(nèi)雌激素代謝水平受月經(jīng)周期特征等因素的影響波動(dòng)太大;而絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素的水平相對(duì)較低，且較為穩(wěn)定，因此本研究重點(diǎn)比較分析了絕經(jīng)后乳腺癌患者與健康女性之間的雌激素水平變化，考察其與乳腺癌發(fā)生機(jī)制的相關(guān)性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者體內(nèi)E1、E2及其羥基化產(chǎn)物2-OHE2和4-OHE2含量顯著增加;而16α-OH

7、E1和2-MeOE2含量顯著降低。進(jìn)一步結(jié)合雌激素的代謝途徑和致癌機(jī)制，發(fā)現(xiàn)雌激素的代謝途徑存在著不平衡狀態(tài)，這與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。乳腺癌患者體內(nèi)高水平的前體物質(zhì)(E1和E2)之間可以協(xié)同作用，增加了自發(fā)突變率，造成直接的遺傳毒性，最終將增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。2-,4-羥基化途徑起著主導(dǎo)作用，尤其來(lái)自E1和E2羥基化反應(yīng)的2-OHE2和4-OHE2是最為關(guān)鍵的兩個(gè)代謝產(chǎn)物，通過(guò)醌類(lèi)物質(zhì)的介導(dǎo)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)了乳腺

8、癌的發(fā)生。此外，2-MeOE2可以抑制腫瘤細(xì)胞的快速增生，降低基因毒效應(yīng)，體現(xiàn)了甲基化的解毒作用。而16α-羥基化途徑起著次要作用，16α-OHE1水平的變化與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展可能沒(méi)有密切關(guān)系。因此，綜合分析認(rèn)為E1，E2，2-OHE2和4-OHE2為可能的致癌性分子標(biāo)志物，而2-MeOE2可能是潛在的抑癌分子標(biāo)志物;它們?cè)谌橄侔┑陌l(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。本項(xiàng)結(jié)果對(duì)乳腺癌的早期診斷、篩查、預(yù)防等具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　

9、 3.基于RRLC-MS/MS方法的乳腺癌血樣代謝組學(xué)研究
　　 采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式相結(jié)合的RRLC與QTOF型MS/MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，開(kāi)展了乳腺癌血樣的代謝組學(xué)研究。作為乳腺癌體內(nèi)雌激素代謝輪廓分析及其雌激素類(lèi)標(biāo)志物的補(bǔ)充，通過(guò)對(duì)72例乳腺癌患者和81例健康女性血漿樣本的代謝組學(xué)研究，旨在發(fā)現(xiàn)更多的特異性小分子生物標(biāo)志物，獲得更全面、完整的代謝物變化信息，從而為揭示乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制提供豐富及可靠