NADPH氧化酶4介導(dǎo)的腫瘤能量代謝在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和分子影像學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是威脅人類健康的主要疾病。盡管乳腺癌的治療取得了進(jìn)步，但仍約有1/3的早期乳腺癌患者在治療中繼續(xù)發(fā)展，發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移成為乳腺癌患者死亡的重要原因。因此了解乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尤為重要。由于能量代謝是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要支撐，近年來，腫瘤的能量代謝成為了研究的熱點(diǎn)。氟-18-氟代脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層顯像(18fluorodeoxyglucose positron emissiontomography,18F-F

2、DG PET)顯像應(yīng)用腫瘤的診斷中，其生物學(xué)基礎(chǔ)既為基于腫瘤的Wrburg效應(yīng)。腫瘤的Wrburg效應(yīng)由化學(xué)家Otto Wrburg于80余年前首次發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞生物能量主要依賴線粒體氧化磷酸化，然而，由于腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙，其能量主要依賴于有氧糖酵解，線粒體功能障礙的另一表現(xiàn)形式為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加。
　　ROS對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響越來越受到重視，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(ni

3、cotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是除線粒體外，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來源。NADPH氧化酶與其它將ROS作為副產(chǎn)物的酶系統(tǒng)不同，NADPH氧化酶的主要功能為產(chǎn)生ROS。因此，探討NADPH氧化酶對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響具有重要意義。NADPH氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase4，NOX4)復(fù)合體不需要

4、RAC蛋白（小分子GTP酶蛋白）活化，是一直處于活化狀態(tài)的氧化酶，既往NOX4在疾病中的作用研究主要集中在心臟和糖尿病中，在腫瘤中的作用并不明確。有研究報(bào)道NOX4在乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌組織中有高表達(dá)，但其表達(dá)的生物學(xué)意義及與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系篩查尚不清楚。
　　基于以上的研究背景，本課題擬研究不同糖酵解能力的乳腺癌NOX4的表達(dá)水平及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系;進(jìn)一步以高糖酵解的乳腺癌細(xì)胞系為工具細(xì)胞，探討NOX4對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響，研究N

5、OX4表達(dá)對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移影響的分子機(jī)制;應(yīng)用靶向線粒體功能的分子影像研究不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌線粒體功能差異，以期為乳腺癌的轉(zhuǎn)移的治療提供新的靶點(diǎn)并通過分子影像學(xué)可視化乳腺癌的能量代謝。
　　方法：
　　本研究入組術(shù)前行18F-FDG PET/CT顯像乳腺癌患者。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測乳腺癌患者標(biāo)本NOX4表達(dá)。收集患者的一般病理資料并進(jìn)行病例隨訪，分析不同乳腺癌糖酵解率中表達(dá)率及與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　本

6、研究通過18F-FDG乳腺癌細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)篩選高糖酵率的乳腺癌細(xì)胞，以高糖酵解的乳腺癌細(xì)胞為工具細(xì)胞，應(yīng)用基因沉默技術(shù)，降低細(xì)胞NOX4表達(dá)，通過免疫印跡分析和RT-PCR驗(yàn)證NOX4沉默效率;實(shí)驗(yàn)分三組:空白對(duì)照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性siRNA-NOX4轉(zhuǎn)染組;免疫印跡方法檢測三組細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)相關(guān)分子HIF-1α和TGF-β表達(dá)水平的差異;

7、通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析三組細(xì)胞的侵襲能力差異;通過免疫印跡方法檢測線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基煙酰胺嘌嶺二核苷酸脫氫酶黃素蛋白1(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase flavoprotein1)NDUFV1表達(dá)水平;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測三組細(xì)胞線粒體膜電位、凋亡和ROS水平的差異。
　　本研究擬合成新的靶向腫瘤線粒體分子探針鎵-68-麗絲胺羅丹明B(68Gallium

8、-Lissamine Rhodamine B，68Ga-LRB)進(jìn)行腫瘤顯像;建立不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌模型鼠，并分別行靶向線粒體的68Ga-LRB Micro-PET和18F-FDG顯像;評(píng)價(jià)不同侵襲轉(zhuǎn)移能力腫瘤的68Ga-LRB和18F-FDG攝取率是否有差異;應(yīng)用18F-FDG顯像動(dòng)態(tài)觀察MDA-MB-231腫瘤模型鼠表阿霉素化療后腫瘤能量代謝的變化。
　　結(jié)果：
　　1、入組術(shù)前行1

9、8F-FDG PET乳腺癌患者56例，腫瘤組織NOX4蛋白表達(dá)與糖酵解具有顯著性相關(guān);
　　2、乳腺癌患者腫瘤組織NOX4表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著性相關(guān)(x2=4.52,P＜0.05);
　　3、高侵襲力的MDA-MB-231較低侵襲力的MCF-7乳腺癌細(xì)胞系具有高糖酵解率(t=10.52，P＜0.05);
　　4、抑制MDA-MB-231細(xì)胞的NOX4表達(dá)，下調(diào)EMT相關(guān)因子HIF-1α、和TGF-β表達(dá)（P均＜0

10、.01);降低了細(xì)胞的侵襲力(P＜0.01);
　　5、抑制MDA-MB-231細(xì)胞的NOX4表達(dá);上調(diào)NDUFV1表達(dá)(P＜0.01);降低線粒體膜電位(P＜0.01)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，降低ROS產(chǎn)量(P＜0.01);
　　6、成功合成靶向腫瘤線粒體的顯像劑68Ga-LRB;
　　7、腫瘤對(duì)68Ga-LRB的攝取低于18F-FDG攝取;MDA-MB-231模型鼠應(yīng)用表阿霉素化療后腫瘤18F-FDG攝取

11、率較對(duì)照組無顯著性降低(P均＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、本研究證實(shí)乳腺癌NOX4表達(dá)水平與糖酵解具有相關(guān)性;NOX4表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移，因而NOX4有望成為乳腺癌轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)。
　　2、本研究初步證實(shí)NOX4失活能夠下調(diào)HIF-1α和TGF-β的表達(dá)，抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力;上調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ亞基NDUFV1表達(dá)，降低線粒體膜電位，降低ROS產(chǎn)量，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　3、