草魚(yú)天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因的表達(dá)分析及其抗病相關(guān)性研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，草魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但是養(yǎng)殖環(huán)境卻有惡化的趨勢(shì)，草魚(yú)在養(yǎng)殖過(guò)程中爆發(fā)的疾病越來(lái)越多，給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。培育具有一定抗病力的草魚(yú)新品系是解決病害問(wèn)題的有效途徑，也是實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)健康發(fā)展的一種趨勢(shì)。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（Nramp）基因作為一種抗病候選基因，與魚(yú)類的先天性免疫密切相關(guān)，在魚(yú)類的抗病研究中具有重要價(jià)值。
　　天然抗性相關(guān)巨噬蛋白（Nra

2、mp）家族是一類抑制胞內(nèi)病原菌侵染的天然免疫相關(guān)蛋白。目前在人和小鼠等哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)兩種具有不同功能的天然抗性巨噬蛋白Nramp1和Nramp2。但在魚(yú)類中，除虹鱒（Nrampα和Nrampβ）外，發(fā)現(xiàn)的Nramp蛋白只有一種，氨基酸序列對(duì)比分析研究表明，魚(yú)類的Nramp基因與哺乳類Nramp2的同源性要高于Nramp1的同源性，但其功能卻與Nramp1相似。
　　本研究以草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）

3、為試驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)比研究了Nramp基因在草魚(yú)胚胎不同發(fā)育階段、不同組織及嗜水氣單胞菌攻毒感染后不同時(shí)間四個(gè)免疫相關(guān)組織的差異表達(dá)情況；通過(guò) RT-PCR技術(shù)獲得草魚(yú) Nramp基因ORF區(qū)，并進(jìn)行了原核表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；用克隆測(cè)序的方法篩選與抗病性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Nramp的功能、生物學(xué)活性和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為揭示草魚(yú)免疫系統(tǒng)抗感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為草魚(yú)抗病品系的培育提供

4、參考。主要研究結(jié)果如下：
　　在草魚(yú)胚胎發(fā)育的不同時(shí)期（卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、心跳期、孵化期和幼魚(yú)期）Nramp基因的mRNA表達(dá)量隨著隨著胚胎的不斷發(fā)育而逐漸增強(qiáng)且變化顯著（P<0.05），在幼魚(yú)期表達(dá)量達(dá)到最大。Nramp基因在成年健康草魚(yú)的13個(gè)不同組織中均有不同程度的表達(dá)，在肝臟中的表達(dá)量最高；其次是在脾、頭腎、腸中的表達(dá)量較高；而在眼和鰾中的表達(dá)量最低。
　　在實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)草魚(yú)進(jìn)行人工感染嗜水氣單胞

5、菌后，在頭腎、肝臟、脾臟、腸中Nramp的表達(dá)量都有顯著變化（P<0.05），在頭腎中感染12h后顯著上升，48h達(dá)到最大，在72h和96h時(shí)又顯著下調(diào)，在7d時(shí)表達(dá)量繼續(xù)下調(diào)而逐漸回歸到初始水平；在肝臟中Nramp基因的表達(dá)量在4h時(shí)出現(xiàn)下調(diào)，在12h又顯著上調(diào)，隨后在24h出現(xiàn)下調(diào)，在48h又上調(diào)，72h達(dá)到最大并保持較高水平到7d；在腸中mRNA表達(dá)量在12h顯著上調(diào)，48h達(dá)到最大，在72h和96h顯著下調(diào)，在7d時(shí)表達(dá)量基本回

6、歸到初始水平；在脾中mRNA表達(dá)量在4h開(kāi)始上升，12h達(dá)到最大，在24h和48h表達(dá)水平顯著下調(diào)，在7d時(shí)表達(dá)量回歸到初始水平。草魚(yú)感染致病菌可引起免疫相關(guān)組織中Nramp的表達(dá)量上升，說(shuō)明Nramp在硬骨魚(yú)類的天然免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　從草魚(yú)組織中提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA后，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增 Nramp基因ORF區(qū)642bp片段，將目的片段雙酶切后連接到pET-32a(＋)原核表達(dá)載體上，經(jīng)酶切和測(cè)

7、序驗(yàn)證，表明成功構(gòu)建了 pET-32a-Nramp原核表達(dá)載體。將重組載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.5 mM/L IPTG誘導(dǎo)6 h后Nramp重組蛋白獲得大量表達(dá)，且以包涵體形式存在。通過(guò)HisTrap HP純化柱純化后獲得與預(yù)期大小一致的片段，經(jīng)過(guò)Western blotting驗(yàn)證了純化的蛋白是目的蛋白。這為Nramp單克隆抗體的制備和利用免疫組化及免疫印跡技術(shù)在蛋白水平研究Nramp基因表達(dá)量的變化奠定了基礎(chǔ)。

8、r>　　通過(guò)PCR克隆測(cè)序的方法篩選草魚(yú)Nramp基因多態(tài)性位點(diǎn)，經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)在Nramp基因3'UTR區(qū)發(fā)生C2419T突變，產(chǎn)生兩種基因型AA基因型和AB基因型。為研究該多態(tài)性位點(diǎn)與草魚(yú)抗病的相關(guān)性，分別對(duì)40條AA基因型和40條AB基因型魚(yú)進(jìn)行嗜水氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn)，不同時(shí)間采血制備血清檢測(cè)這兩種基因型的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、堿性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性四項(xiàng)免疫指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AA基因型、AB基因型這四種酶的活性都有顯著升高