Nurr1基因激活劑在帕金森病模型中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、1.帕金森病的簡(jiǎn)介及發(fā)病機(jī)制
　　 帕金森病(Parkinson's Disease)是一種在老年人中常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1，2，3]。帕金森病的臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫(tremor at rest)，運(yùn)動(dòng)遲緩(bradykinesia)，僵直(Rigidity)等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)障礙。
　　 帕金森病的主要病理學(xué)改變包括:
　　 (1)以中腦黑質(zhì)致密部(subs

2、tantia nigra pars compacta，SNpc)為主的多巴胺能神經(jīng)元(Dopamine，DA)的進(jìn)行性丟失。
　　 (2)胞漿內(nèi)包涵體物質(zhì)即路易小體(Lewybodies)的出現(xiàn)等[4]。
　　 近年來(lái)，廣大學(xué)者通過(guò)大量研究逐漸對(duì)帕金森病的發(fā)病原因，臨床表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制，疾病轉(zhuǎn)歸及治療有了深入系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。帕金森病是一種由多種因素共同作用所導(dǎo)致的綜合性疾病，雖然目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但大量研究證

3、實(shí)，遺傳因素（如Pitx3，Nurr1，α-synuclein，parkin，PINK1，LRRK2等基因的異常表達(dá)），環(huán)境因素（如除草劑、魚(yú)藤酮、MPTP等）氧化應(yīng)激，鐵離子含量增高，興奮性中毒及炎癥反應(yīng)等在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[4，5，6，7，8，9]。近年來(lái)，大量研究證實(shí)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-ProteasomeSystem)功能異常導(dǎo)致的錯(cuò)構(gòu)蛋白聚集也在帕金森病發(fā)病機(jī)制發(fā)揮著重要的作用[10]。

4、r>　　 2.Nurr1(NR4A2)基因在帕金森病中的作用
　　 Nurr1基因是屬于核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，由Law等于1992年首次在小鼠腦cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)[11]。隨后Mages等從外周血T細(xì)胞分離出人Nurr1基因并應(yīng)用多態(tài)性連鎖分析將其定位于2q22-q23[12]。Nurr1基因包含8個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框起始于外顯子的第三個(gè)核苷酸-腺嘌呤，終止密碼子位于外顯子8。Nurr1基因主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在黑質(zhì)(S

5、N)，被蓋腹側(cè)(VTA)，中腦，嗅球，海馬，顳葉皮層，小腦，下丘腦后部和邊緣系統(tǒng)呈現(xiàn)高表達(dá)[13，14，15]。大量研究發(fā)現(xiàn)，Nurr1在中腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育，遷移和存活中發(fā)揮著重要的作用[16，17]。Zetterstrom等還研究發(fā)現(xiàn)Nurr1基因缺乏的小鼠(Nurr1-/-)由于運(yùn)動(dòng)功能障礙及不能吸吮，出生后24小時(shí)內(nèi)即死亡。組織病理學(xué)分析顯示，中腦黑質(zhì)及腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少[16]。在Nurr1基因缺失的雜

6、合子小鼠(Nurr1+/-)研究中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)于乳胞素(lactacystin)所引起的黑質(zhì)損傷的易感性明顯增加[18]。老年（大于15個(gè)月）的Nurr1+/-小鼠的運(yùn)動(dòng)功能較之同齡野生型小鼠顯著降低，中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元顯著減少[19，20]。Le等還在人體外周血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，較之正常對(duì)照人群，其Nurr1基因表達(dá)水平在帕金森病和帕金森綜合癥患者中顯著降低[21，22，23]。
　　 綜上所述，Nurr1基因是中樞神經(jīng)

7、系統(tǒng)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，在中腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程發(fā)揮著重要的作用，使得Nurr1基因可以作為帕金森病治療新策略中的潛在靶點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)的第一部分即在帕金森病小鼠動(dòng)物模型中應(yīng)用一種Nurr1基因激活劑Compound1，通過(guò)對(duì)比應(yīng)用Nurr1基因激活劑Compound1與否的小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，行為學(xué)數(shù)據(jù)，生化檢查等指標(biāo)，衡量此種Nurr1基因激活劑的生物活性及其在帕金森病動(dòng)物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 3.帕金森病

8、模型的建立
　　 為了直觀測(cè)定實(shí)驗(yàn)藥物(Nurr1基因激活劑Compound 1)的治療效果，我們需要構(gòu)建帕金森病動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。乳胞素(lactacystin)是一種高選擇性的泛素-蛋白酶體抑制劑，通過(guò)抑制或破壞泛素蛋白酶體系統(tǒng)的作用，導(dǎo)致錯(cuò)構(gòu)蛋白不能被降解并最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的功能障礙和死亡[24]。
　　 在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證實(shí)直接向小鼠內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle，

9、MFB)立體定向注射乳胞素(lactacystin)會(huì)使其產(chǎn)生類似于帕金森病的神經(jīng)病理特性:中腦多巴胺神經(jīng)元的顯著喪失以及包涵體樣蛋白的聚集。此外，我們還發(fā)現(xiàn)小鼠紋狀體內(nèi)的多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)及二羥苯乙酸(DOPAC)的含量水平明顯下降，而5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的含量變化不明顯，論證了乳胞素(lactacystin)高度選擇性的作用于黑質(zhì)-紋狀體多巴胺通路。
　　 4.Pi

10、tx3基因在帕金森病中的作用
　　 Pitx3是垂體同源盒家族成員，是一種同源域包含轉(zhuǎn)錄因子[25]。小鼠動(dòng)物試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，Pitx3在小鼠胚胎期可在骨骼肌和晶狀體中短暫表達(dá)，而小鼠出生后Pitx3僅特異性的表達(dá)在中腦的SNc區(qū)和VTA區(qū)，與TH幾乎同時(shí)表達(dá)，在中腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[26，27]。Pitx3基因敲除小鼠（Pitx3-/-，無(wú)晶狀體小鼠）較之野生型小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量顯著

11、減少，小鼠運(yùn)動(dòng)能力顯著減弱[28]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，Pitx3還是影響黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元中BDNF和GDNF表達(dá)的重要介質(zhì)[29]。
　　 雖然目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)Pitx3和Nurr1基因以不同的通路影響多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育，但最新研究發(fā)現(xiàn)，在多巴胺能發(fā)育的過(guò)程中，Nurr1基因的轉(zhuǎn)錄活性能夠被SMRT抑制，而Pitx3能夠通過(guò)降低SMRT的抑制作用來(lái)增強(qiáng)Nurr1基因的活性[30]。我們實(shí)驗(yàn)的第二部分即應(yīng)用Pitx3基因

12、缺失小鼠(Pitx3-/-)與Nurr1基因敲除雜合子小鼠（Nurr1+/-）雜交獲得的同時(shí)擁有Pitx3和Nurr1基因缺失的小鼠(Nurr1+/-Pitx3-/-)，通過(guò)一系列免疫及生化等試驗(yàn)方法，測(cè)定其是否與單獨(dú)Pitx3和Nurr1基因缺失小鼠在運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，DA和5-HT及其代謝物含量等指標(biāo)上有區(qū)別。
　　 5.小結(jié)
　　 本論文的實(shí)驗(yàn)部分是在山東大學(xué)與美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院(Baylor Coll