茶多酚緩解雞胚生殖腺氧化損傷的研究.pdf

1、近年來,隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,大量的合成化合物不斷釋放到環(huán)境中,對環(huán)境、生物和人體健康造成了巨大危害。其中一些具有激素樣作用的物質(zhì)被稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemical,EDC),可導致人和動物內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常(如性激素和甲狀腺激素分泌障礙)、生殖器官異常(如精子減少、睪丸癌、乳腺癌)、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如智能低下、多動癥)和免疫系統(tǒng)異常(過敏性疾病增加),嚴重威脅動物和人類的生殖健康。
　　

2、 由于誘導氧化損傷是EDC生殖毒性機制中一個最重要的途徑,那么具有抗氧化活性的物質(zhì),尤其是食源性的植物性化合物,就可能預(yù)防EDC的毒性。茶多酚是從茶葉中提取出來的天然生物抗氧化劑,具有多方面的生物活性,其中抗氧化活性是茶多酚最基本的生物活性。由于EDC能引起白由基的產(chǎn)生和氧化損傷,而茶多酚具有清除自由基、螯合金屬離子的抗氧化作用,為此,本研究通過體內(nèi)、體外試驗,研究茶多酚對活性氧和EDC引起的雞胚氧化損傷的緩解作用,為茶多酚用于防治活

3、性氧和氧化性EDC引起的氧化損傷提供理論依據(jù)。
　　 1.生殖細胞培養(yǎng)模型的建立和應(yīng)用
　　 用膠原酶分散18胚齡雞胚的睪丸,建立生殖細胞-體細胞的無血清共培養(yǎng)模型,培養(yǎng)液中添加了10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8 mol/L亞硒酸鈉(稱ITS培養(yǎng)液)。在該培養(yǎng)模型中,生殖細胞呈圓形生長,而體細胞呈梭狀生長。促有絲分裂物質(zhì)如胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白能維持生殖細胞的存活。胎牛血清能促進細胞的存活,但細胞生長過

4、于旺盛以至難以觀察生殖細胞形態(tài)的變化。而無血清ITS培養(yǎng)體系可防止體細胞的過度增殖,體細胞呈單層生長便于顯微鏡下觀察生殖細胞的形態(tài)變化。用免疫細胞化學法進一步證實了生殖細胞呈c-kit(干細胞因子的受體)染色陽性,而體細胞呈陰性。自由基產(chǎn)生體系黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶(HX-XO)和農(nóng)業(yè)來源的除草劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D,50μg/mL)對生殖細胞呈現(xiàn)毒性作用。從形態(tài)

5、和功能兩方面證明本實驗所建立的雞胚睪丸生殖細胞-體細胞無血清共培養(yǎng)模型可作為體外評價內(nèi)源性激素和外源性物質(zhì)如EDC生物活性的一種簡易、快速、準確并且易于觀察的離體模型,還可用于生殖毒理和繁殖營養(yǎng)調(diào)控機理的研究。
　　 2.茶多酚對黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶引起的生殖細胞氧化損傷的緩解作用
　　 自由基是機體許多生化反應(yīng)的中間代謝物,在正常情況下處于產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中。然而,過量的自由基就會損傷細胞,引起機體功能的障礙。在

6、動物生產(chǎn)中,氧化應(yīng)激通過自由基危害動物的健康,導致生產(chǎn)效率的下降。特別是動物的生殖細胞,對氧化損傷較為敏感,因此自由基的及時清除,如采用抗氧化劑,則有利于動物繁殖機能的正常發(fā)揮。本研究利用精原細胞-體細胞共培養(yǎng)模型研究茶多酚對雞胚精原細胞氧化損傷的緩解作用,由次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的活性氧自由基可引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平升高、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性降低,而茶多酚可將MD

7、A水平、SOD和GSH-Px活性恢復到對照組水平,說明茶多酚通過抗氧化作用對活性氧引起的雞胚精原細胞的氧化損傷具有保護作用。
　　 3.茶多酚對2,4-D引起的生殖細胞氧化損傷的緩解作用(離體研究)
　　 2,4-D是一種廣泛使用的控制雜草生長的除草劑,是內(nèi)分泌干擾物的一種。2,4-D被廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè),并對接觸的人和動物造成了潛在的危害。2,4-D可以通過職業(yè)接觸,或從空氣中、飲水中和土壤中的殘留物危害人和動物的健康。2

8、,4-D對家畜和實驗動物具有胚胎毒、致畸毒和干擾生殖功能的作用。本試驗利用精原細胞-體細胞體外無血清共培養(yǎng)模型研究茶多酚對精原細胞氧化損傷的緩解作用,結(jié)果表明:2,4-D可引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平升高、SOD和GSH-Px的活性降低,而茶多酚可將MDA水平、SOD和GSH-Px活性恢復到對照組水平,說明茶多酚通過抗氧化作用對2,4-D引起的雞胚精原細胞的氧化損傷具有保護作用,其保護作用的機理可能是抑制脂質(zhì)過氧化,清除自由基。

9、>　　 4.茶多酚對活性氧及2,4-D引起的雞胚性腺氧化損傷的保護作用(在體研究)
　　 本實驗研究了茶多酚、HX-XO、2,4-D單獨和聯(lián)合作用對雞胚性分化開始后性腺發(fā)育的影響。在孵化的第10天往氣室內(nèi)注入茶多酚(50μg/枚)、HX-XO(HX,0.5μmol,HX,0.25U/枚)、茶多酚+HX-XO、2,4-D(25μg/枚)和茶多酚+2,4-D,注射體積為50μl。在第19天取出睪丸、卵巢和肝臟,稱重,然后進行形態(tài)學

10、研究。結(jié)果顯示:與對照組相比HX-XO、2,4-D均使睪丸、卵巢質(zhì)量下降,肝臟質(zhì)量沒有明顯變化,而添加茶多酚后睪丸、卵巢質(zhì)量恢復到對照組水平。HX-XO、2,4-D對雌性和雄性生殖細胞表現(xiàn)出強烈的毒性作用,作用于睪丸會導致睪丸萎縮,曲細精管直徑比對照組顯著減少(P＜0.01),雄性的精細管結(jié)構(gòu)也受到破壞,使生精細胞分化受到抑制,使大多數(shù)生殖細胞發(fā)生核固縮和胞質(zhì)空泡化,細胞間隙增大。添加茶多酚后曲細精管直徑有了明顯的增加,生殖細胞也基本恢