慢性髓系白血病急性變期特異miRNA的克隆及鑒定.pdf

1、慢性髓系白血病(CML)是一種骨髓造血干細胞惡性克隆性疾病。病程進展慢,臨床以發(fā)熱、脾腫大、外周血及骨髓中出現(xiàn)大量中幼、晚幼粒細胞等為特征。該病病程分為慢性期、加速期以及急性變期,在病程進入急變期后,患者病情往往會出現(xiàn)迅速惡化,對藥物反應(yīng)差等特點。CML的分子發(fā)病機制現(xiàn)已基本闡明,即t(9；22)(q34；q11)染色體易位,這一改變導(dǎo)致了位于9q34斷裂區(qū)的ABL與22q11斷裂區(qū)的BCR形成BCR-ABL融合基因,后者具有異?；罨?/p>

2、酪氨酸蛋白激酶活性,通過激活一些細胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化和多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,如通過激活參與細胞增殖和分化調(diào)控的Ras-MAPK信號途徑,使造血干細胞增殖凋亡失控和分化異常。由于這一致病機制的明確,針對抑制酪氨酸激酶異?；罨男》肿影邢蛩幬?如伊馬替尼、達沙替尼等相繼問世,使得CML患者的臨床完全緩解率或部分緩解率有了很大的提高。但是,有相當(dāng)一部分患者對于這些藥物出現(xiàn)原發(fā)耐藥,或者即使是藥物敏感的患者,在維持治療若干年后,最終會向加速期及

3、急性變期轉(zhuǎn)化,進而使得病情惡化,并出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象。因此,進一步深入探索CML病情進展的分子機制對于CML的多靶點治療有著重要的意義。
　　 miRNA與多種腫瘤的發(fā)生密切關(guān)系。miRNA的長度較短,因此獲得性或缺失性的功能突變的積累發(fā)生較少,各種突變、啟動子的超甲基化或擴增都很容易引起miRNA的激活或失活。miRNA通過調(diào)控tuRNA的轉(zhuǎn)譯或穩(wěn)定性來參與正常細胞穩(wěn)定狀態(tài)的維持,因此miRNA的異常表達則可能導(dǎo)致其相應(yīng)靶基因的

4、異常。miRNA活性喪失使靶基因過表達,而miRNA激活則會導(dǎo)致靶基因下調(diào),這些可能涉及細胞增殖、凋亡、侵襲和血管發(fā)生等過程。miRNA既可作為抑癌基因,下調(diào)原癌基因的活性,也可作為癌基因,下調(diào)抑癌基因的活性。不同的細胞中,同樣的miRNA可能作為癌基因或抑癌基因,而且在某些特定的細胞中一個miRNA的靶基因往往不止一個,而每一個靶基因又可能受多個miRNA的調(diào)控,組成了錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在轉(zhuǎn)錄后水平上對各種基因進行復(fù)雜的調(diào)控,參與腫

5、瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 miRNA與血液病的發(fā)生密切相關(guān),研究表明miRNA-15和miRNA-1在某些類型的白血病和淋巴瘤中發(fā)生了功能障礙,miRNA-15和miRNA-16定位在染色體13q14區(qū)段,研究發(fā)現(xiàn),65％的CLL患者攜帶miRNA-15和miRNA-16丟失或突變的癌細胞。慢性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤和前列腺癌中也常有該區(qū)段的丟失。這兩種miRNA通過抑制Bcl-2蛋白的表達調(diào)節(jié)細胞凋亡過程,Bcl

6、-2蛋白主要通過作用于線粒體來實現(xiàn)其抑制凋亡的生物學(xué)活性,因此當(dāng)miRNA-15和miRNA-16丟失或突變時,Bcl-2蛋白的表達量上調(diào),細胞凋亡受阻,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
　　 miRNA在CML的進展中也有重要作用。在對CML患者和正常人的單個核細胞及CD34+細胞的157個miRNA進行檢測發(fā)現(xiàn):miRNA-10a、miRNA-150及miRNA-151在CML患者體內(nèi)表達下降,而miRNA-96表達則增高。而在對正常人C

7、D34+細胞和CML患者CD34+細胞進行比較發(fā)現(xiàn),CML慢性期miRNA-17-92家族過表達,而急變期無過表達。約95％以上CML患者有ph染色體,其結(jié)果是在分子水平上形成BCR-ABL融合基因。也有研究表明BCR-ABL融合基因的表達也受到相關(guān)miRNA的影響,如miRNA-17-92、miRNA-203等。
　　 本研究分別以CML初發(fā)患者及CML急性變患者的骨髓原代細胞為研究對象,分別提取兩者的總RNA后,首先進行小R

8、NA的富集,將收集到的小RNA分離后分別加poly(A)尾和5’接頭,然后將連有接頭及poly(A)尾的片段進行逆轉(zhuǎn)錄,所得到的初發(fā)患者及急性變患者的cDNA進行本研究所自行發(fā)明的柱式消減雜交,首先將CML初發(fā)患者骨髓原代細胞中克隆的片段與尼龍膜結(jié)合,然后將CML急性變患者骨髓原代細胞克隆的片段與之進行雜交,最后得到的片段則為CML急性變患者骨髓原代細胞所特有的片段。將這些特有的片段擴增后做轉(zhuǎn)化,然后測序檢測克隆到的小RNA序列。

9、>　　 本實驗中共隨機選取50個陽性克隆進行測序,獲得測序結(jié)果后對獲得的克隆序列進行分析,結(jié)果顯示共有42個克隆條序列因重復(fù)或長度不在miRNA理論范圍內(nèi),剩余的8條序列長度在18-25bp之間,因此,可將這8條序列暫定為候選miRNA序列,暫命名為micro-A、micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H。隨后進行相關(guān)驗證,以確定這8條序列是否為CML急性變患者骨髓

10、原代細胞中所特有的miRNA序列。
　　 目前對確定某小RNA是否為miRNA的標(biāo)準(zhǔn)首先是預(yù)測小RNA的前體是否具有典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu),且小RNA是否處于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的臂上,其次還需要對其進行表達的分析,若小RNA序列能在相應(yīng)的物種中表達,就可以判定此小RNA序列為miRNA序列。本研究中,首先對CML急性變患者骨髓原代細胞中克隆的8條候選miRNA進行了生物信息學(xué)分析,這8條序列都可在Genebank中找到各自的同源序列,并且經(jīng)過在m

11、iRNA數(shù)據(jù)庫中比對,排除已知序列后顯示這8條序列均為未知序列,再經(jīng)過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件分析后表明,8條序列中的micro-B、micro-C、micro-D、micro-E、micro-F、micro-G及micro-H七條序列分別處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖環(huán)上,而micro-A序列則位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的臂上。因此,經(jīng)過第一步的生物信息學(xué)分析判定micro-A是CML急性變患者骨髓原代細胞中特異的miRNA,而另7條則不是。
　　 對于初步判定

12、的micro-A還需進一步檢測其表達情況來最后確定其是否為CML急性變患者骨髓原代細胞特異的miRNA。為了驗證micro-A的表達,我們采用總RNA加poly(A)尾RT-PCR法檢測這條序列在CML急性變患者骨髓原代細胞的表達情況,結(jié)果顯示該序列可表達。同時為了探明micro-A在CML初發(fā)患者骨髓原代細胞中是否也表達,我們同樣做了CML初發(fā)患者骨髓原代細胞總RNA加poly(A)尾RT-PCR法的驗證,結(jié)果沒檢測到micro-A在

13、CML初發(fā)患者骨髓原代細胞中的表達情況。因此,經(jīng)過序列分析及實驗驗證后,本研究最后獲得一條CML急性變患者骨髓原代細胞所特有的miRNA,即micro-A。
　　 在今后的研究中,我們要對本研究中所克隆得到的miRNA做進一步的功能研究,以揭示其與CML發(fā)生的關(guān)系及其在CML中的表達特征和功能意義,闡明CML中的RNA調(diào)控機制,使我們對CML急性變的病因及分子機制得到深入的認識,并發(fā)現(xiàn)以RNA分子為對象的治療靶標(biāo)和早期診斷標(biāo)識,