轉(zhuǎn)錄因子GATA2突變和慢性粒細(xì)胞白血病急性變機(jī)制研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病CHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIA(CML)是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，慢性粒細(xì)胞白血病病程通常分為三個(gè)階段，即慢性期(chronicphaseCP)；加速期(acceleratephaseAP)及急變期(blastcrisisBC)。慢性期主要表現(xiàn)為粒系增生，骨髓、外周血和脾臟中大量粒細(xì)胞積聚，慢性期持續(xù)大約3-5年左右，慢性粒細(xì)胞白血病患者進(jìn)入加速期，加速期一般持續(xù)4-6個(gè)月，加速期

2、原始細(xì)胞，不成熟細(xì)胞比例增高，最后進(jìn)入終末期-急變期。急變期骨髓和外周血中原始細(xì)胞大量積聚，類似于急性白血病表現(xiàn)。那么慢性粒細(xì)胞白血病急性變的潛在機(jī)制是什么呢?如果能夠探明其具體機(jī)制，就有望將慢性粒細(xì)胞白血病阻滯在慢性期，延緩或者切斷其急變，這將會(huì)給患者帶來(lái)福音。另外對(duì)于已經(jīng)處于急變期的患者，也可以設(shè)計(jì)一些針對(duì)急變機(jī)制的靶向新療法以期提高患者生存質(zhì)量。 鑒于此，慢粒急變機(jī)制的研究一直是白血病科研領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Gilliland

3、等提出了白血病發(fā)病機(jī)制的多次打擊學(xué)說(shuō)，他們認(rèn)為急性白血病的發(fā)生需要至少2個(gè)遺傳學(xué)事件，其中一個(gè)事件為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子異常賦予細(xì)胞生長(zhǎng)增殖優(yōu)勢(shì)如FLT3受體突變或BCR/ABL融合蛋白，而另外的分子事件為轉(zhuǎn)錄因子異常如PML-RARα能夠阻止細(xì)胞分化，只有具備這兩類分子事件，急性白血病才會(huì)發(fā)生，這個(gè)理論也適宜于闡述慢性粒細(xì)胞白血病急變機(jī)制，慢性期在BCR/ABL伴蛋自酪氨酸激酶活性持續(xù)升高作用下，細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖優(yōu)勢(shì)，但是急變期主要表現(xiàn)為細(xì)

4、胞分化受阻，因此慢性粒細(xì)胞白血病急變可能需要其他能夠影響細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子異常分子事件協(xié)同。上海血液學(xué)研究所實(shí)施了旨在闡明白血病發(fā)病機(jī)制，尋找亞型特異基因組異常的“白血病基因組解剖學(xué)計(jì)劃”。我們對(duì)85例慢?；颊吆Y查了一組轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)9例患者在急變期伴隨有特異性GATA-2突變，其中8例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS(codingsequence)第1075位堿基T＞G雜合突變，引起相應(yīng)GATA2蛋白第359位氨基酸從亮氨酸突變?yōu)槔i氨

5、酸(L359V)，另外一例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS第1021到第1038位18bp堿基缺失，引起GATA2蛋白第341位至第346位氨基酸的缺失(Δ341-346)。有趣的是伴GATA2突變的9例患者均向粒/單核系細(xì)胞急性變。 第一部分：對(duì)GATA2的這兩種突變蛋白做了相應(yīng)的功能研究。PU.1和CEBPα是調(diào)控造血干細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化的兩種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其中PU.1主要調(diào)控單核細(xì)胞及粒細(xì)胞分化，CEBPα主要調(diào)控粒細(xì)胞

6、的分化。PU.1缺失的小鼠能發(fā)生急性白血病，而CEBPα缺失的小鼠表現(xiàn)為粒細(xì)胞成熟障礙。另外，PU.1和CEBPα突變與急性白血病發(fā)生也有很大關(guān)系。M2b患者AML-ETO能夠下調(diào)CEBPα表達(dá)，還能抑制PU.1的轉(zhuǎn)錄活性，這可能都和白血病發(fā)病相關(guān)。因此，我們著眼于探索GATA2突變體的功能，以及其與PU.1和CEBPα的關(guān)系，從而對(duì)GATA-2突變?cè)诼＜弊冎械淖饔米龀醪教接?。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，體外GST拉下實(shí)驗(yàn)以及螢光素酶激活抑制

7、實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)GATA-2L359V和Δ341-346兩種突變蛋白不喪失與PU.1蛋白的結(jié)合；與野生型GATA-2相比較，L359V與PU.1在體外結(jié)合能力更強(qiáng)；與野生型相比較，GATA2L359V和△341-346能更強(qiáng)抑制PU.1的轉(zhuǎn)錄活性，顯示GATA2突變是功能獲得性突變(gainoffunction)。但對(duì)于CEBPα的轉(zhuǎn)錄活性抑制，GATA2wt，L359V和△341-346無(wú)明顯差異。而PU.1轉(zhuǎn)錄活性減低能引起下游造血細(xì)

8、胞分化相關(guān)靶基因表達(dá)異常從而引起細(xì)胞分化受阻，這可能部分地解釋了伴有GATA2突變CML急性演進(jìn)的潛在機(jī)制。 第二部分和第三部分：在動(dòng)物模型上，進(jìn)一步證實(shí)GATA2突變?cè)诼粤＜?xì)胞白血病急性變中的作用。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)，結(jié)合小鼠造血干細(xì)胞移植技術(shù)，使GATA2突變蛋白和BCR-ABL融合蛋白協(xié)同誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性白血病樣疾病。成功地建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)平臺(tái)。包裝出高滴度的病毒顆粒，在國(guó)內(nèi)首次成功地用BCR-ABL融合基因誘導(dǎo)小鼠

9、發(fā)生了CML樣疾病。而GATA2突變協(xié)同BCR-ABL，組小鼠移植后造血和免疫成功重建，但是GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例從2周時(shí)的10％左右逐漸下降至零，也就意味著目的基因的表達(dá)也呈逐漸下降趨勢(shì)，因此未能誘導(dǎo)出預(yù)期的AML樣表型。提示GATA2過(guò)表達(dá)可能對(duì)造血干細(xì)胞有一定毒性作用，影響造血干細(xì)胞自我更新能力，從而使目的基因不能夠在造血細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)發(fā)揮作用。這與GATA2過(guò)表達(dá)能影響造血干細(xì)胞增殖和分化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致?？赡苄枰M(jìn)一步借助