表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮的構(gòu)建與移植實(shí)驗(yàn).pdf

1、目的： 研究用Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化的人表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞、脫細(xì)胞羊膜為支架在體外構(gòu)建復(fù)合皮膚進(jìn)而移植修復(fù)兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面修復(fù)情況，探討其在創(chuàng)面修復(fù)中的作用，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 取燒傷整形患者植皮手術(shù)剩余皮片標(biāo)本，經(jīng)胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，用Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞，以含表皮生長(zhǎng)因子、角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液等組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)

2、。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況、計(jì)算其克隆形成率。均以角質(zhì)細(xì)胞作對(duì)照。在體外將分離、純化的人表皮干細(xì)胞種植到脫細(xì)胞羊膜上，構(gòu)建成人表皮干細(xì)胞脫細(xì)胞羊膜復(fù)合皮。 在新西蘭白兔背部制作全層皮膚缺損模型并隨機(jī)分組，分別用表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮、脫細(xì)胞羊膜移植覆蓋，以空白創(chuàng)面對(duì)照，觀察全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合情況。各組分別于術(shù)后1周、2周、3周、4周在部分創(chuàng)面取材行常規(guī)H E染色，免疫組織化學(xué)染色，觀察各組創(chuàng)面愈合過(guò)程中的組織結(jié)構(gòu)改建情況。

3、 結(jié)果： 經(jīng)Ⅳ型膠原差速粘附法分離、純化的人表皮干細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察見細(xì)胞呈明顯克隆性生長(zhǎng)并逐漸融合，其克隆形成率與角質(zhì)細(xì)胞的克隆形成率分別為11.67％和4.67％，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。透射電鏡觀察見細(xì)胞胞核大，胞漿少，核漿比例大，胞漿內(nèi)細(xì)胞器少。 用人表皮干細(xì)胞脫細(xì)胞羊膜復(fù)合皮、單純羊膜移植覆蓋修復(fù)兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面，以空白創(chuàng)面為對(duì)照。術(shù)后創(chuàng)面愈合時(shí)間分別為：13.78±1.06d、20

4、.89±1.28d、28.67±1.37d，組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。術(shù)后創(chuàng)面愈合時(shí)的創(chuàng)面收縮率分別為：22.6±1.54％、29.3±1.41％、30.4±1.58％，組間比較人表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮組與單純羊膜組和空白對(duì)照組間的差異有顯著性意義(P＜0.05)，單純羊膜組與空白對(duì)照組組間比較差異無(wú)意義(P＞0.05)。常規(guī)HE染色觀察創(chuàng)面的改建情況顯示：表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮組創(chuàng)面術(shù)后7天，表皮細(xì)胞層較薄，表皮真皮連接界

5、面平坦，皮釘不明顯，真皮層中梭形成纖維細(xì)胞排列紊亂；術(shù)后14天，表皮細(xì)胞層增厚，細(xì)胞分層明顯，出現(xiàn)角質(zhì)細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層、棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層，出現(xiàn)少量皮釘，真皮層梭形成纖維細(xì)胞排列與表皮層平行。單純羊膜組和空白對(duì)照組創(chuàng)面的改建則均較晚，同一時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織的改建沒(méi)有表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮組完善。免疫組織化學(xué)染色觀察顯示表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮組創(chuàng)面表皮細(xì)胞層CK19、HLA-DR術(shù)后7天有陽(yáng)性表達(dá)。Ⅳ型膠原術(shù)后14天在基底細(xì)胞周圍呈線性表達(dá)、

6、較連續(xù)。單純羊膜組創(chuàng)面和空白對(duì)照組創(chuàng)面表皮細(xì)胞層CK19、HLA—DR術(shù)后7天表達(dá)陰性，Ⅳ型膠原術(shù)后14天有部分陽(yáng)性表達(dá)，不連續(xù)。 結(jié)論： 休外構(gòu)建的表皮干細(xì)胞羊膜復(fù)合皮移植修復(fù)兔背全層皮膚缺損創(chuàng)面時(shí)，能加速創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間；創(chuàng)面愈合時(shí)的創(chuàng)面收縮率小。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色示全層皮膚缺損創(chuàng)面上皮化快，真皮層梭形成纖維細(xì)胞排列有序化快，創(chuàng)面表皮層能檢測(cè)到人表皮干細(xì)胞存在。提示表皮干細(xì)