AIB1在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中對(duì)三苯氧胺耐藥作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景: 乳腺癌是危及女性的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家多居女性全部腫瘤的首位，國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)明顯上升，目前已躍居我國(guó)女性惡性腫瘤的第二位，且發(fā)病年齡呈年輕化。隨著對(duì)乳腺癌生物學(xué)特性的深入研究，對(duì)乳腺癌的認(rèn)識(shí)也有了全新的概念。目前研究認(rèn)為乳腺癌自發(fā)病即為全身性疾病，其治療觀念由最初的單純手術(shù)治療發(fā)展到以手術(shù)為主輔以放療化療內(nèi)分泌治療，再到目前的綜合治療理論。綜合治療理論中，手術(shù)治療的主導(dǎo)

2、地位被動(dòng)搖，而內(nèi)分泌治療因治療時(shí)間長(zhǎng)且效應(yīng)持久，已超越化療成為乳腺癌最重要的治療手段之一。多項(xiàng)研究證明，內(nèi)分泌治療的應(yīng)用大大提高了早期乳腺癌的治療效果，而內(nèi)分泌治療在晚期乳腺癌的合理應(yīng)用，也顯著改善了晚期患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)了患者的生存期。 1896年Beatson首先將卵巢切除術(shù)用于治療絕經(jīng)期前婦女的乳腺癌，開(kāi)創(chuàng)了乳腺癌內(nèi)分泌治療的先河。上世紀(jì)60年代，Toft分離出小鼠雌激素受體（ER）蛋白，70年代ICI46474（Tam

3、oxifen）被發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌具有治療作用。三苯氧胺于1977年被FDA批準(zhǔn)用于進(jìn)展期乳腺癌，于1986年用于原發(fā)性乳腺癌輔助治療，在1990年用于淋巴結(jié)陰性的絕經(jīng)前和絕經(jīng)后乳腺癌的輔助治療。對(duì)于ER陽(yáng)性的乳腺癌患者，三苯氧胺可以使年復(fù)發(fā)率下降50％，死亡率下降28％。 以三苯氧胺為代表的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于乳腺癌已有30余年的歷史，是所有激素受體陽(yáng)性乳腺癌內(nèi)分泌治療的首選藥物，并一直作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)。三苯氧胺

4、和雌激素（E）競(jìng)爭(zhēng)性與ER的激素結(jié)合區(qū)結(jié)合后，形成激素-受體復(fù)合物，引起ER構(gòu)像改變，使DNA結(jié)合區(qū)不能暴露，不能激活基因轉(zhuǎn)錄，從而拮抗E的許多活性。三苯氧胺可應(yīng)用于ER（+）、淋巴結(jié)陰性和/或陽(yáng)性的乳腺癌輔助內(nèi)分泌治療，也可用作高危婦女預(yù)防乳腺癌。目前發(fā)現(xiàn)了多種新的內(nèi)分泌治療藥物，但三苯氧胺的標(biāo)準(zhǔn)治療的地位仍無(wú)法被完全取代。三苯氧胺與ER的特性仍是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。一項(xiàng)大規(guī)模隨機(jī)臨床試驗(yàn)證實(shí)，有數(shù)十萬(wàn)應(yīng)用三苯氧胺的乳腺癌患者至今仍保持

5、無(wú)病存活。另有研究報(bào)道，ER陽(yáng)性乳腺癌術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療效果優(yōu)于或等于化療。然而，三苯氧胺敏感的ER陽(yáng)性患者仍可能發(fā)生三苯氧胺耐藥。研究發(fā)現(xiàn)ER（+）的乳腺癌患者經(jīng)過(guò)5年的三苯氧胺輔助治療，可獲得長(zhǎng)期生存率，其效果可以延續(xù)到停藥后5年。但是超過(guò)5年的使用將使乳腺癌產(chǎn)生耐藥。臨床上也只有50％的ER（+）的乳腺癌患者起始對(duì)抗激素治療有效，之后也會(huì)逐漸耐藥，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和死亡。因此，研究?jī)?nèi)分泌治療耐藥的機(jī)制、尋找克服耐藥的方法有十分重要的臨

6、床意義。 乳腺癌擴(kuò)增性抗原1（amplifled in breast cancer1，AIBI）為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞核激素受體共激活劑P160 SRC家族成員，是新定義的一個(gè)原癌基因。AIBI基因定位于人染色體20q12，因最初發(fā)現(xiàn)于人乳腺癌細(xì)胞株擴(kuò)增的染色體區(qū)，故被命名為乳腺癌擴(kuò)增性抗原1（AIB1）。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示P160甾體激素受體共激活劑基因家族能增強(qiáng)細(xì)胞核受體（nuclear receptor，NR）的活性，通過(guò)補(bǔ)充組

7、蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮重要作用。研究顯示AIBI在許多生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，如細(xì)胞的增殖、遷移、分化、性成熟以及一些癌癥的發(fā)生發(fā)展。但是，目前關(guān)于AIBI功能的作用機(jī)制還知之甚少。在人上皮性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，AIB1是SRC家族中唯一擴(kuò)增和高表達(dá)的成員，它能增強(qiáng)三苯氧胺的雌激素樣作用。AIB1還是重要的ER輔助激活因子，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中高表達(dá)時(shí)，具有促進(jìn)腫瘤形成的作用。AIB1丟失后通過(guò)抑制受體的降解和滅活轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)而影

8、響ER的信號(hào)途徑。作為ER的輔助激活因子，AIB1只在ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，而在ER陰性的乳腺癌細(xì)胞系中均不表達(dá)。臨床研究也證實(shí)AIB1普遍存在于ER陽(yáng)性的腫瘤中。而且，AIB1與ERα成正相關(guān)，與ERβ成負(fù)相關(guān)。 激素依賴性乳腺癌中，E與ER結(jié)合是促進(jìn)乳腺癌增殖作用的主要途徑，然而除了E-ER信號(hào)途徑之外，EGFR家族的信號(hào)途徑也是乳腺癌發(fā)病的另一個(gè)重要機(jī)制。HER2作為EGFR家族的重要成員之一，是廣泛應(yīng)用于臨床的預(yù)

9、測(cè)乳腺癌患者內(nèi)分泌治療和腫瘤復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)記物。Kent Osborne等已證實(shí)AIB1和HER2共同作用降低三苯氧胺對(duì)乳腺癌病人的療效。他們對(duì)316例乳腺癌患者術(shù)后進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)沒(méi)用三苯氧胺治療的AIB1高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較好，無(wú)病生存期較長(zhǎng)。相反，接受三苯氧胺治療的AIB1高表達(dá)的乳腺癌患者無(wú)病生存期短。研究結(jié)果表明AIB1和三苯氧胺之間存在密切的相互作用。另有研究表明在AIB1和HER2高表達(dá)的乳腺癌患者中，HER2通過(guò)激活

10、MAPK，而使AIB1和ER磷酸化，導(dǎo)致三苯氧胺的抗雌激素作用明顯減弱，而雌激素作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致耐藥。這不僅使三苯氧胺的抗腫瘤作用消失，而且因三苯氧胺的雌激素作用還加快了腫瘤的生長(zhǎng)。最近報(bào)道AIB1在HER1-3陽(yáng)性的乳腺癌中表達(dá)可以預(yù)測(cè)乳腺癌的早期復(fù)發(fā)和死亡。這對(duì)乳腺癌的內(nèi)分泌治療及預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。 這些研究均表明AIB1在乳腺癌抗雌激素治療耐藥中發(fā)揮重要作用。然而，到目前為止人們還沒(méi)有弄清楚AIB1是如何將三苯氧胺

11、的雌激素拮抗作用轉(zhuǎn)為激活作用的。本課題的目的就是為了闡明在AIB1和HER2高表達(dá)的雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌中三苯氧胺的耐藥機(jī)制。我們研究了在雌激素受體陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中AIB1對(duì)三苯氧胺誘導(dǎo)的雌激素樣作用，從而為其臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分：AIB1基因的RNAi真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 目的: 利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)AIB1的shRNA真核表達(dá)載體。 方法: （1）根據(jù)AIB1特異的si

12、RNA序列和陰性對(duì)照干擾序列合成相應(yīng)的4條寡核苷酸； （2）將兩兩互補(bǔ)的四條寡核苷酸鏈進(jìn)行磷酸化，并退火連接形成互補(bǔ)的雙鏈； （3）將質(zhì)粒pGenesil-1-U6用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，使其線性化； （4）用T4 DNA連接酶將互補(bǔ)的siRNA模板鏈與線性化的質(zhì)粒載體連接； （5）用大腸桿菌DH5α制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)； （6）擴(kuò)增大腸桿菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取細(xì)菌

13、內(nèi)的質(zhì)粒； （7）提取到的質(zhì)粒DNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和純度； （8）重組質(zhì)粒用SalI酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳； （9）將經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性菌液收集1ml，交由武漢晶賽生物技術(shù)公司行DNA測(cè)序。 結(jié)論: 成功構(gòu)建了目的基因pGenesil-shAIB1和陰性對(duì)照pGenesil-shControl的質(zhì)粒表達(dá)載體。 第二部分：AIB1在ER陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中對(duì)三苯氧

14、胺耐藥的作用機(jī)制 目的: （1）研究AIB1的RNAi表達(dá)載體在BT474乳腺癌細(xì)胞中對(duì)AIB1基因的抑制作用； （2）觀察RNAi沉默AIB1基因表達(dá)后，乳腺癌BT474細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，并通過(guò)測(cè)定一些腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)水平，探討AIB1在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中對(duì)三苯氧胺耐藥的作用機(jī)制。 方法: （1）常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌BT474細(xì)胞，利用Lipofectamine2000將pshAIB1載體和pshC

15、ontrol載體轉(zhuǎn)染入BT474細(xì)胞中，用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)AIB1 shRNA的細(xì)胞株； （2）用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)BT474/shAIB1和BT474/shControl細(xì)胞中AIB1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平； （3）臺(tái)盼藍(lán)拒染測(cè)定BT474/shAIB1和BT474/shControl細(xì)胞的的增殖情況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線； （4）測(cè)定MCF-7，BT474，BT474/shAIB1

16、和BT474/shControl四種細(xì)胞在不同濃度的Tam刺激下的增殖情況，以確定各細(xì)胞對(duì)Tam的敏感性；并檢測(cè)干擾前后細(xì)胞對(duì)E2的敏感性變化； （5）流式細(xì)胞儀檢測(cè)BT474/shAIB1和BT474/shControl細(xì)胞在激素和無(wú)激素環(huán)境中細(xì)胞周期的分布情況； （6）Western blot檢測(cè)BT474細(xì)胞在干擾前后及Tam和E2刺激下AIB1，ERα，HER2和pS2蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)論: （1）

17、構(gòu)建的AIB1 RNAi表達(dá)載體經(jīng)證實(shí)對(duì)乳腺癌BT474細(xì)胞中的AIB1mRNA及蛋白的表達(dá)具有干擾效應(yīng)； （2）AIB1基因與乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，并且是激素非依賴性的；AIB1刺激細(xì)胞增殖的作用，部分是通過(guò)加快細(xì)胞周期的進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)的。 （3）在AIB1和HER2高表達(dá)的ER陽(yáng)性的乳腺癌BT474細(xì)胞中；三苯氧胺表現(xiàn)為雌激素激動(dòng)劑作用，從而導(dǎo)致了原發(fā)耐藥；AIB1受抑制后能夠消除這種雌激素激動(dòng)劑作用，從而恢復(fù)