亞低溫介導(dǎo)溫敏型骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療顱腦創(chuàng)傷的研究.pdf

1、目的：本研究采用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），利用pRNS-1質(zhì)粒將溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原基因（temperature sensitive simian virus40 large T antigen gene，tsSV40LTag）轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，獲得溫度敏感型永生化的BMSCs。觀察在不同溫度條件下，溫度敏感型BMSCs的

2、增殖情況。在亞低溫條件下，將其移植至顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）大鼠顱內(nèi)，觀察其對(duì)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　 方法：（1）大鼠原代。BMSCs的分離、培養(yǎng)：分離新出生10 d內(nèi)幼鼠的雙側(cè)股骨和脛骨，剪開長骨兩端骨皮質(zhì)，露出骨髓腔，用低糖DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，然后接種到塑料培養(yǎng)皿中，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長

3、，至第14天單層貼壁細(xì)胞接近90％融合時(shí)，按1：2傳代。以后隨細(xì)胞增殖均80％～90％融合時(shí)，按1：2持續(xù)體外傳代培養(yǎng)。（2）大鼠BMSCs表面標(biāo)志的鑒定：在細(xì)胞懸液中，分別加入適量FITC標(biāo)記CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗體及CD34單克隆抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。（3）BMSCs的溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標(biāo)記：取第5代BMSCs以1×105/ml進(jìn)行細(xì)胞爬片，在細(xì)胞生長融合前48 h、36 h、2

4、4 h、12 h摻入BrdU，使終濃度為10μmol/L，并分別孵育至細(xì)胞融合，測定BrdU的最佳標(biāo)記時(shí)間。BrdU標(biāo)記的BMSCs進(jìn)行免疫熒光染色。（4）pRNS-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs以及陽性克隆的篩選和擴(kuò)增：pRNS-1質(zhì)粒按照脂質(zhì)體LipoVecTM說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后將細(xì)胞移至33℃，用含G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。將篩選后的細(xì)胞傳代擴(kuò)增。（5）RT-PCR檢測BMSCs中tsSV40LTag的表達(dá)：用Trizol試劑提取細(xì)

5、胞中的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。（6）測定33℃和37℃兩種溫度下tsSV40LTag-BMSCs生長曲線。（7）實(shí)驗(yàn)分組與亞低溫治療：隨機(jī)將54只成年雄性SD大鼠分為對(duì)照組、亞低溫治療組、亞低溫+tsSV40LTag-BMSCs移植組。除對(duì)照組外所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受亞低溫治療，對(duì)照組大鼠進(jìn)行常規(guī)處理。（8）制備大鼠液壓TBI模型：各實(shí)驗(yàn)組大鼠使用液壓沖擊腦

6、損傷儀制備大鼠中型TBI模型。（9）大鼠顱內(nèi)移植tsSV40LTag-BMSCs：在亞低溫條件下，采用立體定向引導(dǎo)，向移植組大鼠顱內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)移植tsSV40LTag-BMSCs。（10）TBI大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分：分別于傷后第1天、7天、14天、21天、28天，由同一位不參與實(shí)驗(yàn)分組的評(píng)價(jià)者在相應(yīng)日期的同一時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。
　　 結(jié)果：（1）大鼠原代BMSCs的分離、培養(yǎng)：骨髓細(xì)胞懸液接種到塑料培養(yǎng)皿，1

7、d后可見部分細(xì)胞貼壁，此后貼壁細(xì)胞不斷擴(kuò)增，第14天細(xì)胞匯集成片，進(jìn)行傳代。擴(kuò)增至第5代時(shí)，細(xì)胞形狀趨于一致，呈梭形。（2）BMSCs表面標(biāo)志的鑒定：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，體外培養(yǎng)至第5代的細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44、CD90呈陽性，CD31、CD34、CD45呈陰性，證實(shí)體外培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。（3）BMSCs的BrdU標(biāo)記：48 h作為最佳標(biāo)記時(shí)間，細(xì)胞標(biāo)記陽性率>94％。（4）pRNS-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs的篩選結(jié)果：篩選14

8、 d后可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞集落形成，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡。（5）RT-PCR檢測tsSV40LTag已轉(zhuǎn)染至BMSCs中。（6）在33℃和37℃兩種溫度下tsSV40LTag-BMSCs的生長情況：在33℃時(shí)，tsSV40LTag-BMSCs生長增殖速度較快，在體外培養(yǎng)條件下可連續(xù)傳代增殖。37℃時(shí)，細(xì)胞生長增殖速度明顯減慢，甚至停止生長。（7）大鼠液壓TBI模型制備結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組死亡率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（8）TBI大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功

9、能評(píng)分結(jié)果：大鼠腦創(chuàng)傷后第1天評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），說明創(chuàng)傷模型的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙程度較一致。傷后第7天、14天、21天、28天，各實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分隨時(shí)間有上升趨勢且亞低溫+tsSV40LTag-BMSCs移植組上升更明顯，即神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙得到改善，顱腦創(chuàng)傷呈現(xiàn)康復(fù)趨勢。亞低溫治療組、亞低溫+tsSV40LTag-BMSCs移植組的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均比對(duì)照組有明顯改善；亞低溫+tsSV40LTag-BMSCs移植組