新型陽離子磷酸膽堿聚合物載反義寡核苷酸抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:心血管病基因治療是目前心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),但高效安全的基因載體依然是限制其推廣應(yīng)用的瓶頸。與病毒類載體相比,非病毒載體在轉(zhuǎn)染效率,生物相容性和安全性等方面表現(xiàn)出了越來越多的優(yōu)勢(shì)。本研究應(yīng)用新型陽離子磷酸膽堿聚合物(PC polymer)作為非病毒類轉(zhuǎn)基因載體,通過反義寡核苷酸(AS-ODN)技術(shù)抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖,以達(dá)到通過基因治療手段防治心血管疾病的目的。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散

2、射儀和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)不同濃度的材料溶液進(jìn)行表征。
　　 2.將MPC30-DEATo與針對(duì)c-myc基因的AS-ODN(c-myc AS-ODN)在不同條件下形成不同N/P比值的基因復(fù)合物(N/P=0,0.5,1,3和5:1),應(yīng)用DNA凝膠電泳法對(duì)復(fù)合物進(jìn)行表征。
　　 3.應(yīng)用MTT法檢測(cè)MPC30-DEA70對(duì)HEK293細(xì)胞和VSMCs的細(xì)胞毒性。
　　 4.將MPC30-DEA70/AS-ODN基因復(fù)

3、合物轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞和SD大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和熒光強(qiáng)度。
　　 5.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)基因復(fù)合物的細(xì)胞相容性和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　 6.western blot法檢測(cè)VSMCs中c-myc蛋白的表達(dá)。
　　 7.繪制VSMCs的生長(zhǎng)曲線,觀察轉(zhuǎn)染c-myc AS-ODN后的細(xì)胞增殖抑制率。
　　 結(jié)果:
　　 1.材料MPC30-DEA70在pH

4、=4.0-11.0范圍內(nèi)的0.01M PBS溶液中顯示出高度的水溶性,其粒徑分布性和正電呈現(xiàn)pH依賴性,隨pH值降低粒徑分布變窄而正電性增強(qiáng)。
　　 2.N/P=0,0.5,1,3和5:1的MPC30-DEA70/AS-ODN基因復(fù)合物在DNA凝膠電泳中顯示出不同程度的電泳遲滯,隨電性增強(qiáng)而顯著。
　　 3.MTT法檢測(cè)MPC30-DEA70在對(duì)HEK293細(xì)胞和VSMCs增殖抑制呈劑量依賴性,隨著MPC30-DEA70

5、濃度的增加,抑制效果明顯,在高濃度時(shí)也顯示出一定的細(xì)胞毒性。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在HEK293細(xì)胞和VSMCs中,復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率和熒光強(qiáng)度隨N/P比值增加而顯著增強(qiáng),與對(duì)照組相比有顯著差異。
　　 5.共聚焦顯微鏡觀察到AS-ODN分子在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),提示其有效的核定位。
　　 6.westernblot法檢測(cè)到應(yīng)用MPC30-DEA70轉(zhuǎn)染c-mycAS-ODN后c-myc蛋白表達(dá)的下降。