木霉菌Tr31幾丁質酶的酶學性質及其基因克隆研究.pdf

1、幾丁質酶普遍存在于各種動物、植物和微生物中,在醫(yī)藥、食品、環(huán)保、生防等許多領域顯示出廣闊的應用前景。國內外已經(jīng)篩選出多種幾丁質酶產(chǎn)生菌,并將其進行分離純化。但只有部分在實際中得到應用,主要原因是菌株的產(chǎn)酶能力較低。因此篩選出產(chǎn)酶活力高、穩(wěn)定的菌株是解決問題的一條重要途徑。木霉菌作為一種生防菌,在生物防治中占有極其重要的地位,在其重寄生過程中產(chǎn)生的幾丁質酶能夠降解多種病原菌細胞壁。
　　 本文從木霉菌Tr31產(chǎn)幾丁質酶的確定、菌種

2、的鑒定、幾丁質酶的分離和酶學性質研究以及幾丁質酶基因的克隆等幾個方面進行了研究,結果如下:
　　 通過透明圈法和DNS法來確定木霉菌Tr31是否產(chǎn)幾丁質酶,結果發(fā)現(xiàn):木霉菌Tr31在以膠體幾丁質為唯一碳源的平板上生長,并沒有透明圈的出現(xiàn)。通過DNS法檢測后發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液變成了棕紅色,說明菌株能產(chǎn)生幾丁質酶。
　　 在幾丁質酶純化過程中,首先對10000NMWC、50000NMWC、100000NMWC型號的超濾膜進行篩選,

3、最終確定10000NMWC的超濾膜為最佳型號。通過硫酸銨沉淀試驗,以沉淀比活力最大為依據(jù),確定硫酸銨飽和度90％為最佳濃度。菌株發(fā)酵液經(jīng)超濾、(NH4)2SO4沉淀,沉淀物經(jīng)脫鹽后得到粗酶液。將粗酶液進行SephadexG-100柱層析,分離出2個蛋白峰,其中僅峰2具幾丁質酶活性。收集幾丁質酶蛋白,對其進行SDS-PAGE電泳,得出該蛋白的分子量約為46kDa。該幾丁質酶最適反應溫度是50℃,最適反應pH值為5.0。幾丁質酶的穩(wěn)定性測定

4、結果表明,酶液在30℃以下溫度處理1h,酶性質穩(wěn)定;在pH4-7條件下處理1h,活性基本不變。Ca2+、Mg2+、Ba2+等金屬離子對酶活力有明顯的激活作用,而Cu2+、Fe3+、Zn2+等對該酶有明顯的抑制作用。
　　 采用培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征觀察法對木霉菌Tr31進行鑒定,發(fā)現(xiàn)該菌株與棘孢木霉的形態(tài)特征非常相似;進一步對該菌株的rDNA-ITS序列進行克隆并測序,發(fā)現(xiàn)該菌株的ITS序列與GenBank中已報道的棘孢木霉的ITS

5、序列的同源性高達100％,證實該菌株為棘孢木霉Trichodermaasperellum。
　　 根據(jù)幾丁質酶基因序列保守區(qū)設計簡并引物、再根據(jù)克隆到的幾丁質酶基因片段序列設計特異性引物,運用RT-PCR、RACE-PCR、TAIL-PCR技術,從木霉菌Tr31中克隆出完整的幾丁質酶基因。該基因cDNA全長1465bp,閱讀框架（ORF）位于61～1335位核苷酸之間,編碼424個氨基酸,信號肽長度為22個氨基酸。全長DNA序列