重組綿羊甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)的制備及其對(duì)綿羊抗病效果的分析.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)又稱作甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, MBL),在有機(jī)體天然免疫系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用,通過(guò)不依賴抗體的補(bǔ)體激活作用,該蛋白將有機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)啟動(dòng),繼而發(fā)揮免疫調(diào)理的作用,因此,它在抵抗病原體感染中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MBL生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)有賴于其完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),MBL結(jié)構(gòu)基因突變影響了蛋白多聚體的功能性和穩(wěn)定性,使得MBL血

2、清濃度明顯降低,機(jī)體的免疫防御和監(jiān)視能力削弱,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)多種病原的易感。此外,由于綿羊支原體肺炎難于控制和消滅,并且在新疆較為嚴(yán)重。因此本研究以MBL和綿羊肺炎支原體(Mycoplasma Ovipneumoniae,MO)為研究對(duì)象進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn),以探究MBL與綿羊支原體肺炎及其他傳染性疾病的相關(guān)性,為今后研發(fā)治療綿羊支原體肺炎的藥物提供了理論依據(jù),研究結(jié)果如下:
　　(1) ELISA檢測(cè)中國(guó)美利奴羊感染綿羊肺炎支原體的免疫應(yīng)

3、答變化:選擇3只羔羊作為對(duì)照組,13只為實(shí)驗(yàn)組,在相同飼養(yǎng)條件下人工感染綿羊肺炎支原體,采集攻毒前1d、攻毒后1d、7d、14d、21d的血清,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)不同個(gè)體免疫因子,如TNF-α、IFN-γ、補(bǔ)體C1、C3的水平。結(jié)果顯示感染MO后,IFN-γ水平第1d降低,第7d達(dá)到最高,即15.13(pg/ml),之后又開(kāi)始降低,但與攻毒前水平相比仍然較高;TNF-α的水平有所升高,升高幅度較正常對(duì)照組不明顯,在第

4、14d出現(xiàn)最高水平32.78(pg/ml),但之后降低;C1水平差異不顯著;C3水平第1d降低,之后升高,第21天出現(xiàn)最高值12.66(mg/ml)。結(jié)論:通過(guò)IFN-γ、TNF-α、補(bǔ)體C1、補(bǔ)體C3水平的變化情況,可以推測(cè)綿羊患支原體肺炎的程度。
　　(2)人工感染綿羊肺炎支原體后MBL變化及組織病理學(xué)分析:感染MO后,ELISA檢測(cè)MBL水平,并對(duì)不同MBL水平的羔羊進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分,以對(duì)其肺炎程度進(jìn)行量化評(píng)價(jià),結(jié)果顯示攻

5、毒前血清MBL水平越高,組織病理學(xué)評(píng)分越低,所以可得:MBL對(duì)綿羊肺炎支原體有一定的抗性。
　　(3)天然、重組綿羊MBL的制備:利用PEG-6000從綿羊血清中提取天然MBL。分別將真核表達(dá)載體 pPIC9K和克隆載體 pMD18-T-MBL經(jīng) Not I、SnaB I雙酶切,然后連接獲得重組表達(dá)載體pPIC9K-MBL,將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,將獲得的天然、重組MBL行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果為:天然、重組MBL中均有預(yù)

6、測(cè)的條帶出現(xiàn)。結(jié)論:天然MBL中也有非預(yù)測(cè)的條帶,因此獲得的天然MBL不純;重組MBL表達(dá)量少,不足以進(jìn)行后續(xù)純化。
　　(4)細(xì)胞、個(gè)體水平研究攻毒后,MBL對(duì)免疫因子TNF-α和IL-2的影響:感染前實(shí)驗(yàn)組分別注射人MBL和羊MBL,結(jié)果為:細(xì)胞水平上,24h時(shí)注射人MBL、羊MBL和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組間TNF-α變化量差異顯著,48h、72h時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間差異顯著,實(shí)驗(yàn)組內(nèi)差異不顯著;24h、48h、72h時(shí)三者之間IL-2