急性白血病MLL基因重排的檢測(cè)及臨床特點(diǎn)研究以及基因斷裂融合檢測(cè)新方法初探.pdf

1、目的： 1.研究急性白血病(acute leukemia，AL)中混合譜系白血病(mixed lineage leukemia.MLL)基因重排的多重巢式(multiplex nested)RT-PCR方法檢測(cè)，并探討其生物學(xué)和臨床特點(diǎn)。 2.研究AL中MLL基因重排在監(jiān)測(cè)微小殘留病(minimal residual disease，MRD)中的作用和意義。 3.建立一種檢測(cè)RAR0c、AML1及MLL等基因斷裂

2、融合的新的篩選方法。 方法： 1.MLL基因重排的檢測(cè) 1.1 對(duì)171例AML和76例ALL患者用Multiplex Nested RT-PCR方法進(jìn)行MLL基因重排的檢測(cè)，選取轉(zhuǎn)錄因子E2A作為內(nèi)對(duì)照同步進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。檢測(cè)的MLL基因重排包括MLUA/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/FL、LMLL/ENL、MLL/AFX1、MLL/IP、MLL/1Q和ML

3、L-PTD等11種。 1.2 流式細(xì)胞技術(shù)采用活細(xì)胞三色熒光標(biāo)記檢測(cè)的免疫表型。 1.3 對(duì)部分AL患者作染色體核型分析。 2.B/C比值法的建立 2.1 B區(qū)和C區(qū)引物設(shè)計(jì)在正常RARα、AML1和MLL的cDNA模板上，分別針對(duì)RARer、和MLL基因的斷裂點(diǎn)區(qū)B區(qū)(Breakpoints region)設(shè)計(jì)引物，上游引物和下游引物分別位于斷裂點(diǎn)區(qū)兩端，并在非斷裂位點(diǎn)區(qū)C區(qū)(Control regio

4、n)作為內(nèi)對(duì)照，分別設(shè)計(jì)引物C1和C2。 2.2 最佳線性循環(huán)擴(kuò)增數(shù)的確定取正常對(duì)照cDNA，分別用RARα、AML1和MLL基因的B區(qū)和C區(qū)引物，根據(jù)各自的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)依次為26、28、30、32、34、36。然后取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，記錄條帶灰度值，并做出線性擴(kuò)增曲線，確定最佳線性循環(huán)數(shù)。 2.3 確定反應(yīng)所需的骨髓原始細(xì)胞最低比例NB4細(xì)胞系(PMIURARα陽(yáng)性)和K562細(xì)胞系(PML/RARα陰性)按一

5、定比例混合(NB4細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的O％，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)共形成11組混合細(xì)胞，提取RNA后以RARα基因的擴(kuò)增條件和循環(huán)數(shù)進(jìn)行RT-PCR，從細(xì)胞系水平確定反應(yīng)所需的最低原始細(xì)胞比例。 選取骨髓原始細(xì)胞比例為96.4％的PML/RARct融合基因陽(yáng)性標(biāo)本，按15％、30％、45％、60％、75％、90％原始細(xì)胞比例與正常對(duì)照混合，分別測(cè)定B/C值，從病例水平確定B

6、/C比值法要求的入選標(biāo)本最低原始細(xì)胞比例。 2.4 B/C比值法準(zhǔn)確性驗(yàn)證選取30例已知PML/RARα陽(yáng)性標(biāo)本和正常對(duì)照各30例以B/C比值法檢測(cè)，計(jì)算B/C值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)PML/RARα、AML1/ETO融合基因和MLL基因重排陽(yáng)性者，分別作B/C比值法檢測(cè)，計(jì)算B/C值，與正常對(duì)照比較。 結(jié)論： 1.多重RT-PCR是臨床檢測(cè)MLL基因重排較為精確和靈敏的方法。

7、 2.在AML中MLL基因重排是FAB亞型M4和M5常見的基因改變，多見于WBC增高患者；ALL中MLL基因重排以MLL/AF4為主，多見于pro-B ALL。MLL基因重排的急性白血病AL患者CR率與陰性者無明顯差異，但預(yù)后較差。 3.MLL基因重排可作為MRD的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，在AL判斷復(fù)發(fā)和治療方案的個(gè)體化選擇及預(yù)后方面有重要意義。 4.B/C比值法是一種創(chuàng)新性的方法。實(shí)質(zhì)是一種半定量.PCR方法，是一種有效的判斷RA