Dlx5基因在室管膜前下區(qū)神經(jīng)干細胞中的表達規(guī)律及其對神經(jīng)元分化的影響.pdf

1、研究背景和目的： 神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells，NSCs)是能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞。因此，神經(jīng)干細胞有可能成為腦組織移植的新型供體源，能較好地解決神經(jīng)移植治療的倫理道德及供體不足等問題，可望成為解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生的一條新途徑。此外，也為了解和闡明神經(jīng)發(fā)育機制提供了有力的證據(jù)。 位于側腦室附近的室管膜前下區(qū)(Anteriorsubv

2、entricularzone，SVZa)是神經(jīng)干細胞較為集中的地方之一。從胚胎期至成年階段，此區(qū)神經(jīng)干細胞在體內(nèi)背-腹信號控制下，不斷沿著嘴側遷移流(Rostralmigratorystream，RMS)向嗅球(Olfactorybulb，OB)遷移，最后在OB分化為中間神經(jīng)元，并成為其終身更新的來源。此區(qū)神經(jīng)干細胞具有以下特點：(1)能長距離定向遷移；(2)自產(chǎn)生起即具備發(fā)育為神經(jīng)元的潛能；(3)在遷移過程中始終維持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元分

3、化潛能而不進一步分化。因此，SVZa神經(jīng)干細胞成為研究神經(jīng)干細胞增殖、遷移和分化調(diào)控機制研究的較佳模型，并成為神經(jīng)干細胞研究的重點。 在SVZa神經(jīng)干細胞向OB遷移、分化的過程中，需要很多內(nèi)在和外在的因素來共同控制。研究表明，Dlx(distall-lesshomeobox)基因家族中的Dx5基因與OB中間神經(jīng)元的發(fā)育密切相關。因為基因敲除鼠的實驗表明：Dlx5基因在OB中間神經(jīng)元分化和OB受體神經(jīng)元軸突連接中起著主要作用；是O

4、BSVZ祖細胞成熟為分離后的局部環(huán)路(中間)神經(jīng)元所必須的；而且只對嗅系統(tǒng)發(fā)育有關的神經(jīng)干細胞的分化進行調(diào)節(jié)，是出生后神經(jīng)發(fā)生必須的基因。因此推測，Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細胞向OB定向遷移及分化的過程中起著重要的作用，但上述研究對Dlx5基因的作用及其機制還遠未闡明。本研究以SVZa神經(jīng)干細胞的遷移、分化模型為基礎，以體外培養(yǎng)的新生大鼠SVZa神經(jīng)干細胞為研究對象，通過基因轉染等方法研究Dlx5基因在SVZa神經(jīng)干細胞中的表達規(guī)律

5、及其對神經(jīng)元分化的影響，這方面的研究鮮見報道。 方法： 1.運用DNA重組技術，將小鼠Dx5基因(mDx5)從原核表達質(zhì)粒上用內(nèi)切酶消化下來，插入到EGFP質(zhì)粒C-末端的多克隆位點中，構建一個可以用于真核細胞基因轉染的Dx5重組質(zhì)粒，并通過雙酶切及DNA測序來鑒定。 2.通過免疫細胞化學方法檢測Dlx5、Er81、Islet1蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS和OB中的表達情況，以了解SVZa細胞的分子生物

6、學特性和表型，以及它們與神經(jīng)干細胞遷移分化的關系。 3.運用細胞培養(yǎng)技術對SVZa神經(jīng)干細胞進行分離、增殖、傳代培養(yǎng)，用免疫熒光細胞化學方法對其干細胞特性及分化潛能進行鑒定；還用Dlx5、Er81、Islet1抗體聯(lián)合檢其蛋白在SVZa及紋狀體來源的神經(jīng)干細胞中的表達情況，以比較不同部位來源的神經(jīng)干細胞中這些分子特性及表型的異同。 4.通過基因轉染、RT-PCR、WesternBlot等方法研究重組質(zhì)粒在SVZa神經(jīng)干細

7、胞中的表達情況； 5.運用活體熒光標記，詳細研究基因轉染細胞分化后的形態(tài)特征，并用免疫熒光雙標確定分化細胞的類型，以了解Dlx5基因轉染與神經(jīng)元分化的關系。 6.提取每一代SVZa神經(jīng)干細胞的總RNA，用RT-PCR檢測其內(nèi)源性Dlx5mRNA的表達情況，并用不表達內(nèi)源性Dlx5mRNA的細胞進一步研究：用重組質(zhì)粒轉染該代神經(jīng)干細胞，了解外源轉染基因mRNA的表達情況，同時了解其內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況；用BMP

8、-2處理該代神經(jīng)干細胞24小時后，用同樣的方法了解內(nèi)源性Dlx5mRNA的變化情況。 7.最后，分別將傳代后，還表達內(nèi)源性Dlx5mRNA代次的神經(jīng)干細胞；繼續(xù)傳代后不再表達內(nèi)源性Dlx5mRNA的神經(jīng)干細胞；基因轉染已不再表達內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細胞；BMP-2處理已不再表達內(nèi)源性Dlx5mRNA的該代神經(jīng)干細胞分化后，用流式細胞儀檢測它們的神經(jīng)元分化比例。 結果： 1.新構建的重組質(zhì)粒命名為pE

9、GFP-mDlx5，經(jīng)過雙酶切后分別產(chǎn)生了一個780bp的mDx5基因插入片段及4680bp的EGFP載體片段，大小與預期結果相符；測序后，將序列在GeneBank中用Blast軟件進行同源性比對，結果，780bp插入片段與已知小鼠Dlx5基因的同源性為100％，而且開放閱讀框沒有移位； 2.Dlx5、Er81蛋白主要定位于細胞核，胞漿內(nèi)也存在。Er81蛋白分布比較廣泛，在新生大鼠很多腦區(qū)都有表達，包括OB、RMS、SVZa、紋

10、狀體、海馬、大腦皮層下等；除紋狀體外，Dlx5蛋白也在上述腦區(qū)中表達；Dlx5及Er81蛋白在生后0天及7天大鼠SVZa、RMS、OB中表達都比較強，而且，分布的區(qū)域相似，呈重疊表達的方式，在OB主要分布于顆粒細胞層和球周細胞層。Islet1蛋白不在SVZa、RMS、OB中表達，主要存在于紋狀體，在大腦皮層下也能檢測到。 3.體外培養(yǎng)的SVZa來源的神經(jīng)球細胞通過鑒定，干細胞標記物Nestin陽性，而且能分化成神經(jīng)系統(tǒng)三種譜系的

11、細胞，還具有Dlx5、Er81蛋白陽性，Islet1蛋白陰性的分子生物學特性和表型，而紋狀體來源的神經(jīng)球細胞則是Er81、Islet1蛋白陽性，Dlx5蛋白陰性的。 4.重組質(zhì)粒轉染SVZa神經(jīng)干細胞后，4小時開始出現(xiàn)綠色熒光，8小時后增多明顯，24到48小時達高峰，并持續(xù)較長時間。24小時后RT-PCR檢測到外源轉染基因的mRNA表達，WesternBlot檢測到58KD目的蛋白表達。表明pEGFP-mDlx5能在SVZa神經(jīng)

12、干細胞中穩(wěn)定表達，是一個有用的工具； 5.通過活體熒光標記發(fā)現(xiàn)，基因轉染成功的細胞都分化成了有突起的細胞，其形態(tài)特點主要有兩種：只有兩條突起，分別向相反方向伸長，形成兩個極；有一很長的、分支較少的突起，類似軸突，而其他突起短、細，有分支。經(jīng)過NSE雙標證實，這些細胞為神經(jīng)元樣細胞。 6.常規(guī)傳代培養(yǎng)下，SVZa神經(jīng)干細胞中內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達具有一定的規(guī)律性：在第1至第3代時，RT-PCR能檢測到內(nèi)源性Dlx5

13、mRNA表達，繼續(xù)傳代至第4代時，表達消失；不過，這種改變是可逆的，用Dlx5重組質(zhì)粒轉染第4代細胞后24小時，不但外源轉染基因mRNA有表達，內(nèi)源性Dlx5基因mRNA也恢復了表達；用100ng/ml的BMP-2處理第4代細胞后24小時，內(nèi)源性Dlx5基因也能重新出現(xiàn)。 7.相應地，上述四種Dlx5mRNA表達狀態(tài)的神經(jīng)干細胞分化后，用FCM檢測到的神經(jīng)元比例分別為：19.16±0.75％；8.34±0.36％；35.66±0

14、.58％；22.27±0.12％。單因素方差分析表明：各組間兩兩比較，神經(jīng)元分化比例均有顯著差異，P＜0.05。 結論： 1.聯(lián)合檢測SVZa神經(jīng)干細胞中Dlx5、Er81、Islet1蛋白表達能區(qū)別其它部位如紋狀體來源的神經(jīng)干細胞，Dlx5、Er81蛋白表達陽性，Islet1蛋白陰性是SVZa神經(jīng)干細胞的分子特性和表型之一； 2.常規(guī)體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細胞中，內(nèi)源性Dlx5基因mRNA表達具有一定的規(guī)律性