室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和遷移的影響因素及機(jī)制研究.pdf

1、位于側(cè)腦室壁SVZ的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)具有自我更新、增殖、干性維持、遷移和分化為神經(jīng)系統(tǒng)主要神經(jīng)細(xì)胞亞群的潛能。近年來研究證實(shí)SVZ的NSCs可在腦損傷（如:腦缺血、腦出血、腦外傷）后，發(fā)生原位激活，增殖、遷移，并在損傷灶處分化為功能神經(jīng)元，整合于受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)功能。盡管研究證實(shí)了其在腦組織損傷后的功能，但腦組織受損后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和向損傷灶遷移能力有限，影響腦損傷后的功能康

2、復(fù)。因此，針對(duì)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞這一特殊的細(xì)胞群體，研究增強(qiáng)其增殖和遷移能力的藥物及潛在機(jī)制具有重大的基礎(chǔ)研究和臨床意義。
　　組織pH值是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮功能的重要微環(huán)境參數(shù)，病理?xiàng)l件下如腦缺血后可引起大量酸性物質(zhì)的堆積，使得缺血核心區(qū)周圍組織pH可下降至6.5，嚴(yán)重時(shí)6.0以下，它的變化必然會(huì)影響SVZ神經(jīng)干細(xì)胞功能，因此我們推測(cè)微環(huán)境酸化對(duì)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的遷移會(huì)產(chǎn)生抑制作用。同時(shí)，青蒿琥酯(Artesunate)具有高效、低毒、

3、易通過血腦屏障的特性，在臨床中被廣泛用于瘧疾的治療，近年來研究表明其也有抗腫瘤的作用。但其對(duì)SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用未見相關(guān)研究，我們推測(cè)適當(dāng)濃度的ART可促進(jìn)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。為驗(yàn)證以上兩種推測(cè)的正確性，本研究以SVZ神經(jīng)干細(xì)胞為切入點(diǎn)，結(jié)合離體和在體實(shí)驗(yàn)，綜合應(yīng)用免疫熒光、激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)、藥理學(xué)、生化與分子生物學(xué)等方法，闡述ART對(duì)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用及ASIC1a對(duì)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞遷移的抑制作

4、用及可能機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下:
　　第一部分 酸敏感離子通道1a對(duì)SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞遷移中的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞，采用免疫熒光方法檢測(cè)酸敏感離子通道1 a(acid-sensing ion channels1a，ASIC1a)蛋白在NSCs的表達(dá);建立不同酸化梯度環(huán)境，研究其對(duì)NSCs遷移的影響;并采用PcTX1研究酸敏感離子通道對(duì)NSCs遷移影響的可能機(jī)制。
　　方法：

5、
　　通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞，以PO包被后，分別將神經(jīng)干細(xì)胞球(neurospHere)置于以下各組:對(duì)照組(pH7.4)、pH6.0組pH6.5組、pH6.8組、pH7.0組、pH7.2組，24h后以倒置相差顯微鏡觀察各組遷出的細(xì)胞數(shù)目及遷行距離，篩選對(duì)遷移影響最明顯的pH值;以CCK8法檢測(cè)各組之間pH對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞球活性的影響;免疫熒光法行Nestin和ASIC1a之間的雙標(biāo)、RT-PCR及WB確認(rèn)ASIC1a在NSCs

6、上的表達(dá);設(shè)置對(duì)照組(pH7.4)、pH6.8組、pH6.8+ PcTX1組，分別在24h以倒置相差顯微鏡和Transwell法觀察ASIC1a對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響，并以WB檢測(cè)各組之間ASIC1a蛋白表達(dá)水平的差異;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以同樣的分組，在紋狀體區(qū)分別注入20μl各pH值的生理鹽水，動(dòng)物造模成功后腹腔內(nèi)注射Brdu(50mg/Kg)，并于3天時(shí)將動(dòng)物處死，以Brdu+Nestin免疫熒光雙染，觀察SVZ向酸化灶處遷移的細(xì)胞數(shù)目和距離

7、。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ASIC1a對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在pH6.0和pH6.5的酸性環(huán)境中，神經(jīng)干細(xì)胞的活性與對(duì)照組相比受到明顯影響;
　　2.在pH6.8的酸性環(huán)境中，神經(jīng)干細(xì)胞的活性未見明顯影響，但神經(jīng)干細(xì)胞從細(xì)胞球向外遷出的數(shù)量和距離明顯減少和縮短;
　　3.ASIC1 a+與nestin+的神經(jīng)干細(xì)胞共標(biāo)，且通過RT-PCR和WB分別檢測(cè)了mRNA和蛋白的表達(dá)，即:ASIC1a在N

8、SCs上表達(dá);
　　4.pH6.8酸性環(huán)境中NSCs的遷移受到抑制，ASIC1a在該效應(yīng)中起重要作用;PcTX1可減弱該現(xiàn)象;
　　5.pH6.8組的微環(huán)境酸化遷移模型中SVZ向酸化灶處遷移的Brdu+細(xì)胞數(shù)目明顯減少，當(dāng)應(yīng)用PcTX1后，該現(xiàn)象減弱。
　　結(jié)論：
　　ASIC1a在NSCs上的表達(dá);神經(jīng)干細(xì)胞在pH6.8的酸性環(huán)境中遷移能力受到明顯抑制;ASIC1a與酸性環(huán)境中NSCs遷移能力受到抑制相關(guān)，Pc

9、TX1可減弱酸性環(huán)境中抑制NSCs遷移的現(xiàn)象。
　　第二部分 青蒿琥酯調(diào)控AKT促進(jìn)大鼠SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖的體外研究
　　目的：
　　通過體外培養(yǎng)SVZ神經(jīng)干細(xì)胞，采用CCK8及Ki-67免疫熒光方法檢測(cè)不同濃度青蒿琥酯對(duì)NSCs增殖的影響，并利用PI3K-AKT通路阻斷劑(LY294002)干預(yù)后，采用WB方法評(píng)估該通路在ART促進(jìn)NSCs增殖中的潛在作用和機(jī)制。
　　方法：
　　設(shè)置不同濃度的ART分

10、組:400 nmol/L組、800 nmol/L組、1.6μmol/L組、3.2μmol/L組，作用于體外培養(yǎng)的NSCs24h后，利用CCK8試劑孵育2.5h后利用多功能酶標(biāo)儀在波長450nm處測(cè)定光密度值[D(450)]，并于促增殖作用最明顯的ART濃度組加入10μmol/L LY294002，再次采用CCK8法檢測(cè)LY294002對(duì)NSCs增殖的影響。設(shè)置如下4組:Ctrl(DMSO)、LY294002組、800 nmol/L AR

11、T組、800 nmol/L ART+LY294002組，待細(xì)胞培養(yǎng)24h后，采用Ki-67免疫熒光雙標(biāo)研究PI3K-AKT通路在其中的作用，同時(shí)采用WB方法檢測(cè)各組Nestin、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示在450nm處光密度值800 nmol/L ART組較空白對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，在加入10μmol/L LY294002后，其光密度值明顯下降，與空白對(duì)照組水平相

12、當(dāng);
　　2.Ki-67免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:800 nmol/LART可明顯促進(jìn)NSCs增殖，10μmol/LLY294002可抑制這一作用;
　　3.WB結(jié)果顯示:Nestin及p-AKT蛋白表達(dá)水平在800 nmol/L ART組明顯上調(diào)，在加入10μmol/L LY294002后兩者表達(dá)水平均下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　800 nmol/L ART在體外可促進(jìn)SVZ分離培養(yǎng)的NSCs的增殖，其