SOCS2調(diào)控大鼠室管膜前下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervoussystem，CNS)存在的具有自我更新自我增殖能力和多種分化潛能的特殊細(xì)胞群。NSCs廣泛存在于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中側(cè)腦室附近的室管膜前下區(qū)(Anteriorsubventricularzone，SVZa)被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中NSCs最為集中的部位之一。研究發(fā)現(xiàn)SVZa的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生后，逐漸向嗅球(Olfactorybu

2、lb，OB)遷移，在從SVZa遷移到OB的過(guò)程中形成一條高度局限的遷移通道——喙側(cè)遷移流(Rostralmigratorystream，RMS)，位于遷移流中的神經(jīng)干細(xì)胞保持增殖狀態(tài)和神經(jīng)干細(xì)胞特征而不進(jìn)一步分化，在遷移到嗅球后才進(jìn)一步分化成熟。SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化以及在喙側(cè)遷移流通道遷移的過(guò)程中，不但受到遺傳因素的影響，而且受到多種細(xì)胞因子(環(huán)境因素)的調(diào)控作用。 細(xì)胞因子是一類(lèi)由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化的

3、多肽小分子，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的各種生物效應(yīng)具有廣泛多樣的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞因子通過(guò)其受體和受體介導(dǎo)的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。CNS中研究較多的細(xì)胞因子有生長(zhǎng)激素(Grouthhormone，GH)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)、胰島素(insulin)、IGF-1(insulin-likegrowthfactor)等等。細(xì)胞因子的效應(yīng)又受多種因子的調(diào)節(jié)，包括SOCS家族。SOCS(suppressors

4、ofcytokinesignaling，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)可被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)通路具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的蛋白分子，參與多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的信號(hào)調(diào)節(jié)。SOCS蛋白最初被認(rèn)為是JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，受多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)這些因子有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。SOCS家族有CIS和SOCS1-7共8個(gè)成員，分別在不同的組織表達(dá)并被不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)，調(diào)控不同的JAK/STAT途徑。SO

5、CS2是SOCS家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2mRNA在動(dòng)物胚胎和成年的許多組織都有表達(dá)，且在發(fā)育和成年的動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)。最初發(fā)現(xiàn)SOCS2是GH信號(hào)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，后來(lái)發(fā)現(xiàn)胰島素與SOCS2也有密切關(guān)系。最新研究表明SOCS2是一種潛在的神經(jīng)分化調(diào)控因子，能促進(jìn)NSC向神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，對(duì)神經(jīng)元的功能具有重要作用，但其作用機(jī)制不清，是最近研究的熱點(diǎn)之一。除此之外研究發(fā)現(xiàn)SOCS2還能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，當(dāng)中樞

6、神經(jīng)系統(tǒng)以及PC12細(xì)胞過(guò)度表達(dá)SOCS2時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞的突起增長(zhǎng)增多。 另一方面，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)是胰島素的不敏感組織，胰島素不能通過(guò)血腦屏障，并且對(duì)腦功能無(wú)明顯影響。最近的研究發(fā)現(xiàn)上述傳統(tǒng)觀點(diǎn)并不正確。實(shí)際上胰島素能跨越血腦屏障，并且對(duì)腦功能的正常發(fā)揮有重要作用：胰島素不僅調(diào)節(jié)腦對(duì)葡萄糖的利用，而且調(diào)控腦細(xì)胞的神經(jīng)傳遞活動(dòng)、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、影響動(dòng)物的飲食和體重，并且是神經(jīng)生長(zhǎng)、分化和發(fā)揮功能所必需的因子。外源性胰島

7、素被認(rèn)為是一個(gè)能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)整突觸可塑性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并對(duì)突起的生長(zhǎng)及細(xì)胞分化起重要調(diào)控作用。 此外研究表明胰島素能夠激活SOCS家族基因如SOCS1,SOCS2,SOCS3及CIS的表達(dá)。在C2C12細(xì)胞中，胰島素能通過(guò)STAT5途徑誘導(dǎo)SOCS2mRNA的表達(dá)。不僅如此，有學(xué)者在研究胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑的調(diào)控時(shí)，用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)SOCS2與胰島素受體(insulinreceptor,IR)之間能夠直接相互作

8、用，但SOCS2調(diào)控胰島素的機(jī)制還不清楚。SOCS2基因敲除的小鼠比正常小鼠的體積顯著增大表現(xiàn)為巨大癥，有學(xué)者推測(cè)原因之一可能是SOCS2作為細(xì)胞因子信號(hào)的抑制因子，負(fù)反饋調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子/IGF-1信號(hào)途徑，其缺失后對(duì)生長(zhǎng)激素及胰島素等生長(zhǎng)因子的抑制作用下降。 SOCS2作為一種細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子，與神經(jīng)元的發(fā)育分化密切相關(guān)，那么SOCS2是否參與了SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化調(diào)控?它在喙側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞遷移流通道即SVZa

9、-RMS-OB中的表達(dá)特征如何?既然SOCS2和胰島素均能影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化及突起的生長(zhǎng)，并且在某些細(xì)胞系中SOCS2與胰島素受體之間能夠相互作用，那么SOCS2和胰島素對(duì)SVZaNSCs發(fā)育分化有何影響?在SVZaNSCs中SOCS2是否也是胰島素發(fā)揮作用的重要中間因素?即胰島素是否通過(guò)促進(jìn)SOCS2的表達(dá)發(fā)揮作用? 為了解決以上問(wèn)題，本研究以不同發(fā)育階段的大鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)及Wes

10、ternblotting技術(shù)從mRNA水平及蛋白水平在體觀察SOCS2在不同發(fā)育階段大鼠腦內(nèi)SVZa、RMS、OB三個(gè)不同區(qū)域的時(shí)空表達(dá)模式；并以離體培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞為模型，用不同濃度的胰島素及胰島素抗體刺激使其在體外進(jìn)行分化，比較觀察胰島素對(duì)NSCs分化時(shí)突起生長(zhǎng)的影響，以及對(duì)SOCS2蛋白表達(dá)的影響，探討SOCS2和胰島素之間的相互關(guān)系及它們對(duì)SVZaNSCs分化的影響；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步嘗試構(gòu)建SOCS2真核表達(dá)質(zhì)粒，為更

11、好地研究SOCS2在CNS中的功能奠定基礎(chǔ)。所得主要結(jié)果如下： 1.應(yīng)用RT-PCR、原位雜交組織化學(xué)以及Westernblotting等技術(shù)檢測(cè)SOCS2在不同發(fā)育階段大鼠的OB、RMS、SVZa三個(gè)區(qū)域的表達(dá)得出基本一致的結(jié)果：mRNA水平：從空間上看，SOCS2在RMS區(qū)表達(dá)較弱，在OB和SVZa區(qū)較強(qiáng)。從時(shí)間上看，SOCS2在出生前后(E17.5，P0，P14)表達(dá)較強(qiáng)，成年后減弱。蛋白水平：SOCS2蛋白在各個(gè)階段的表

12、達(dá)均以O(shè)B區(qū)最強(qiáng)，SVZa區(qū)次之，RMS區(qū)最弱。在OB區(qū)，胚胎期的表達(dá)比P0天弱，PO天表達(dá)最強(qiáng)，而后隨著年齡的增加表達(dá)迅速下降；在RMS和SVZa區(qū)，SOCS2蛋白的表達(dá)在胚胎期最強(qiáng)，隨著年齡的增加而逐漸降低。 2.原位雜交和免疫組化雙標(biāo)顯示GFAP陽(yáng)性細(xì)胞與SOCS2mRNA陽(yáng)性細(xì)胞共存率為6.29％，NF-200陽(yáng)性細(xì)胞與之的共存率為92.56％，另外幾乎所有觀察到的TH陽(yáng)性神經(jīng)元均顯示SOCS2mRNA陽(yáng)性，此外有少數(shù)n

13、estin陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)SOCS2mRNA陽(yáng)性。 3.相差倒置顯微鏡觀察到胰島素對(duì)SVZaNSCs分化時(shí)的突起生長(zhǎng)有顯著影響。在分化早期(分化6h，分化12h)，10ng/mlinsulin組和100ng/mlinsulin組的細(xì)胞突起平均長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于正常分化組，且100ng/mlinsulin的促細(xì)胞貼壁(分化)效應(yīng)較10ng/mlinsulin明顯。在分化的后期(分化24h，72h)10ng/mlinsulin組和100ng/

14、mlinsulin組的突起平均長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于正常分化組，且以100ng/mlinsulin組的促突起生長(zhǎng)的作用最明顯。而insulinAb組的細(xì)胞貼壁(分化)最慢，但在分化早期對(duì)突起生長(zhǎng)的影響與正常分化組相比并不顯著，在分化的后期則有明顯抑制突起生長(zhǎng)的效應(yīng)。 4.NSCs正常自然分化時(shí)，分化各時(shí)相點(diǎn)均有SOCS2蛋白的表達(dá)，SOCS2主要在胞漿中表達(dá)，在少數(shù)胞核及突起也有表達(dá)。SOCS2的表達(dá)在分化早期較強(qiáng)，隨著分化時(shí)間的增加強(qiáng)度

15、有所減弱。 5.免疫熒光顯示insulin組NSCs的分化比正常分化組快，并且胰島素能使SOCS2的表達(dá)增加，SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞比例較正常分化組增加，但是SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯改變。 6.Westernblotting顯示100ng/mlinsulin能使SVZaNSCs的SOCS2蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組及insulinAb組的顯著增加(P＜0.01)，另外insulinAb組的SOCS2表達(dá)水平比正常對(duì)照組顯

16、著降低(P＜0.05)，表明在NSCs中，SOCS2的表達(dá)受到胰島素的調(diào)控，胰島素能使SOCS2表達(dá)上調(diào)。 7.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)顯示100ng/mlinsulin能使神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例增高。胰島素抗體能夠抑制胰島素的作用。 8.成功構(gòu)建了SOCS2真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV5-SOCS2-GFP。 結(jié)論： 1.從mRNA水平和蛋白水平發(fā)現(xiàn)了SOCS2在大鼠喙側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞遷移流通道的發(fā)育學(xué)表達(dá)具有時(shí)空特

17、異性，這種時(shí)空特異性提示SOCS2可能參與SVZaNSCs的增殖、遷移和分化。 2.SOCS2的表達(dá)主要存在于神經(jīng)元中，與神經(jīng)元的發(fā)育分化密切相關(guān)，并可能與神經(jīng)元特別是多巴胺能神經(jīng)元的功能相關(guān)。 3.胰島素能促進(jìn)NSCs的分化，并對(duì)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且有劑量依賴(lài)性。 4.在NSCs中，SOCS2與胰島素也有密切關(guān)系，SOCS2的表達(dá)受到胰島素的調(diào)控，胰島素能誘導(dǎo)SOCS2表達(dá)上調(diào)。 5.SOCS2

18、和胰島素能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，其作用機(jī)制之一可能是胰島素誘導(dǎo)SOCS2表達(dá)上調(diào)，然后SOCS2誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化。 本研究首次從基因水平和蛋白水平全面揭示了SOCS2在大鼠喙側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞遷移流通道的發(fā)育學(xué)表達(dá)特征，并以離體培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞為模型，初步探討了SOCS2與胰島素的關(guān)系及二者對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育分化的影響，提示SOCS2對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育分化有重要調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究神經(jīng)干細(xì)胞的增