利用TALEN雙修飾敲除位于AT-豐富區(qū)脆性位點基因FATS的小鼠模型研究.pdf

1、分類號： R 7 3 0 ．2密 級：學(xué)位類別： 科學(xué)學(xué)位團 專業(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼：1006 2學(xué) 號：2 0 1 0 6 0 2 0 2 2學(xué)科門類：理學(xué)天湃醬科鼻垮了I A N J I NM E D I C A l - U N l V E R S l T Y碩士學(xué)位論文T ⅥA S T E R ’S D I S S E R T A T I O N論文題目：利用T A L E N 雙修飾敲除位于A T - 豐富區(qū)脆性位點基因F A T

2、S 的世鼠模型研究T I T L E ：E f f i c i e n t t a r g e t i n go f F A T S a t A T - r i c hs e q u e n c e i nm i c et h r o u g h T A L E N - m e d i a t e d d o u b l e - h i tg e n o m e m o d i f i c a t i o n一級學(xué)科：生物學(xué)二級學(xué)科：生

3、物化學(xué)與分子生物學(xué)論文作者：馬克指導(dǎo)教師：李政教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一三年五月大滓醫(yī)科人學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶( T A L E N ) 作為一種新的基因修飾方法，自2 0 1 1年以來成功應(yīng)用于基因修飾以及動物模型的產(chǎn)生。F A T S 基因?qū)儆诖嘈晕稽c基因，其編碼序列位于基因組中A T 富含區(qū)，特別是其有重要功能的最大外顯子被含有重復(fù)序列的大片段A T 富含區(qū)所包圍，難以用常規(guī)胚胎干細(xì)胞同源重組方法

4、實現(xiàn)定位敲除。為了建立F A T S 基因敲除小鼠模型，我們通過構(gòu)建T A L E N 打靶載體，并創(chuàng)新性地用T A L E N 雙修飾法進行F A T S 基因敲除，探索高效建立基因敲除小鼠模型的新途徑。方法1 ．采用生物信息學(xué)方法分析小鼠的F A T S 基因的編碼序列，確定打靶載體的設(shè)計位點。針對其最大外顯子部位設(shè)計兩對T A L E N 載體，確保打靶成功率。2 ．采用G o l d e nG a t e 的方法組裝T A L

5、E N 打靶載體，載體組裝完成后通過P C R和測序驗證打靶載體是否正確，將序列正確的克隆進行質(zhì)粒D N A 提取和純化。3 ．將F A T S —T A L E N 打靶質(zhì)粒D N A 通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染小鼠H C l l 細(xì)胞，7 2 小時后提取細(xì)胞基因組D N A ，進行T 7 E 1 酶切實驗，并通過T - A 克隆測序驗證F A T S - T A L E N 打靶載體在細(xì)胞水平上的體外切割效率。4 ．體外鑒定F A T S

6、．T A L E N 載體有效后，將打靶載體D N A 酶切線性化，通過T 7轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄成具有5 ’帽子和3 ' p o l y A 尾巴的成熟m R N A 。對小鼠單細(xì)胞期受精卵進行原核注射，注射后的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)。5 ．待小鼠出生后，剪腳趾編號進行基因鑒定，確定陽性小鼠( F 0 ， f o u n d e r ) 。同時檢測F A T S ．T A L E N 打靶載體在這些F O 小鼠中是否有打靶非特