單核增生李斯特氏菌適體的篩選、結(jié)構(gòu)分析與特異性的研究.pdf

1、中文摘要中文摘要本文應(yīng)用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化( S E L E x ) 技術(shù)對單核增生李斯特氏菌( L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s ) 進(jìn)行適體篩選，旨在篩選出能與該菌具有高親和力特異性結(jié)合的D N A 適體，為食品中單核增生李斯特氏菌的檢測研究奠定一定的基礎(chǔ)。本文在對單核增生李斯特氏菌的S E L E X 體外篩選過程中，利用反向篩選技術(shù)去除與單核增生李斯特氏菌存在的共同表位抗原，

2、加快針對單核增生李斯特氏菌特異表位抗原適體的富集過程。經(jīng)過1 4 輪的篩選，對篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，并對測序部分適體進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的分析、結(jié)合率的測定以及特異性的研究。S E L E X 篩選結(jié)果表明，每輪的s s D N A 富集文庫與單核增生李斯特氏菌的結(jié)合率呈上升趨勢，結(jié)合顯色后吸光度值從第1 輪的0 ．2 6 4 上升到第1 4 輪的0 ．6 5 9 ，提高了近2 ．5 倍。一級結(jié)構(gòu)保守序列顯示有5 對適體序列完全一致

3、，另有部分適體序列只有一個(gè)堿基不同，而且C C C ( T G ) C ( G ) G G G ( C A ) 這1 2 個(gè)堿基在1 1 個(gè)適體序列中都有，這說明一級結(jié)構(gòu)同源性的適體有了一定程度的富集。二級結(jié)構(gòu)模擬圖以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主，說明這些莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)是適體與靶分子進(jìn)行結(jié)合作用的基礎(chǔ)，也是其進(jìn)一步形成三維空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。適體與單核增生李斯特氏菌的結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，B 0 9號適體的結(jié)合率最大，1 2 7 號適體的結(jié)合率最小。B 0 9 號適

4、體特異性實(shí)驗(yàn)顯示，B 0 9號適體與單核增生李斯特氏菌結(jié)合后的吸光度值最大，為0 ．7 6 0 ；說明B 0 9 號適體具有一定程度的特異性，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：單核增生李斯特氏菌，S E L E X ，適體，P C R ，結(jié)合率，特異性A b s t r a c tA b s t r a c tI nt h i ss t u d y , i n o r d e r t ol a ya f o u n d a t

5、i o n f o rt h ed e t e c t i o no f L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e si nf o o d ，S E L E X m e t h o dw a s u t i l i z e dt os c r e e nD N A a p t a m e r s t h a ts p e c i a l l y b i n d L i s t e r i am o

6、n o c y t o g e n e s w i m a h i g h a f f i n i t y ．I nv i t r os e l e c t i o np r o c e s sa g a i n s t L i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ，r e v e r s es c r e e n i n g m e t h o dw a s u s e dt or e m o v

7、 et h ec A ) m m o na n t i g e n t h a te x i t e dt h eb a c t e r i at oa c c e l e r a t et h ep r o c e s so fa p t a m e r e n r i c h m e n t a g a i n s t s p e c i f i c a n t i g e n o nt h e b a c t e r i a ．A

8、 f t e r 14 r o u n d s o fs e l e c t i o n ，t h es c r e e n e dp r o d u c t sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d ．T h ep r i m a r ys t r u c t u r ea n ds e c o n d a r y s t r u c t u r eo f t h es e q u e n c

9、 e da p t a m e r sw a s a n a l y z e d ．T h ec o m b i n a t i o nr a t ea n ds p e c i f i c i t yo f t h ea p t a m e r s w a s a l s os t u d i e d ．T h eS E L E X s c r e e n i n g r e s u l t ss h o w e d t h a tt

10、 h ec o m b i n a t i o nr a t eo f s s D N A e n r i c h e dl i b r a r yo fe a c h r o u n da n dL i s t e r i a m o n o c y t o g e n e sh a di n c r e a s e d ，a n dt h ea b s o r b a n c ev a l u eh a dr a i s e dn

11、e a r l y 2 ．5t i m e s ，f r o m0 ．2 6 4 o f t h ef i r s tr o u n d t o0 ．6 5 9o f t h ef o u r t e e n t hr o u n d ．T h e c o n s e r v e ds e q u e n c e so fp r i m a r ys t r u c t u r e a l s or e v e a l e d t h

12、a t f i v e p a i r so fa p t a m e r sh a di d e n t i c a ls e q u e n c e s ．T h e r ew a so n l yo n ed i f f e r e n tb a s ei ns e q u e n c e so fa n o t h e r p a r to f a p t a m e r s ．A n d11 a p t a m e r s h

13、 a d t h es e q u e n c e o f C C C ( T G ) C ( G ) G G G ( C A ) ．T h i ss u g g e s t e dt h a tt h ea p t a m e r sw i t h p r i m a r ys t r u c t u r eh o m o l o g yh a db e e ne n r i c h e d t os o m ee x t e n t

14、 ．T h e s e c o n d a r ys t r u c t u r e c o n s i s t e d m a i n l y o fS t e m - l o o p s t r u c t u r e ．T h i si m p l i c a t e d t h a tt h e s eS t e m ．1 0 0 p sw e r et h eb a s i sf o ra p t a m e r sb i n

15、 d i n g t ot a r g e tm o l e c u l e sa sw e l la st h eb a s i sf o ri t sf u r t h e rf o r m t h et h r e e ．d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e ．T h ee x p e r i m e n t so f a p t a m e rb i n d i n gt oL i s t

16、 e r i am o n o c y t o g e n e ss h o w e d t h a t t h ec o m b i n a t i o nr a t eo f N O ．B 0 9 a p t a m e r w a s m a x i m u m ，a n dt h e c o m b i n a t i o nr a t eo f N O ．1 2 7a p t a m e r w a s m i n i m u

17、 m ．T h e s p e c i f i c i t ye x p e r i m e n t so f N O ．B 0 9a p t a m e rr e v e a l e dt h a tt h ea b s o r b a n c ev a l u eo fN O ．B 0 9a p t a m e r b i n d i n g t o L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s

18、 w a sm a x i m u m ( 0 ．7 6 0 ) ．T h i si m p l i c a t e dt h a tN O ．B 0 9a p t a m e rh a da c e r t a i nd e g r e eo f s p e c i f i c i t y ．A n dt h i sh a dl a i dac e r t a i n f o u n d a t i o nf o rs u b s e